[发明专利]蛋白质功能化磁珠亲和探针及其制备方法与应用

说明书

本发明涉及DNA分离、富集和检测领域，公开了一种蛋白质功能化磁珠亲和探针及其制备方法与应用，该亲和探针包括表面修饰有过渡金属离子的磁性微米粒子和负载在所述磁性微米粒子表面的N末端修饰有组氨酸标签的DNA损伤应答蛋白。本发明还包括了蛋白质功能化磁珠亲和探针的制备方法与应用。本发明构筑的蛋白质功能化磁珠亲和探针不仅结构稳定，只需负载少量蛋白样品，而且合成简单，成本低廉。此外，本发明蛋白质功能化磁珠亲和探针在使用时只需要少量的DNA损伤片段样品，即可实现DNA损伤片段的高效捕获，而且分离快速、简单，简化了操作步骤，省时、省力。

技术领域

本发明涉及DNA分离、富集和检测领域，具体涉及一种蛋白质功能化磁珠亲和探针及其制备方法与应用。

背景技术

以顺铂为代表的铂类抗肿瘤药物是细胞毒性抗肿瘤药物的典型代表。自1969年Rosenberg发现顺铂(Cisplatin)抑制细胞生长的生物活性以来，顺铂已成为临床上使用最为广泛的抗肿瘤药物，第二代铂类药物卡铂、奥沙利铂等也已相继进入临床使用。顺铂进入人体后，可扩散通过带电的细胞膜进入细胞质内，被转运至细胞核，在染色质内和DNA形成一种链内交联复合物，造成显著的DNA损伤，从而阻碍基因的复制和转录，激活凋亡通路最终导致细胞死亡。然而，顺铂同时也会带来严重的毒副作用，以及患者持续用药后产生的抗药性等并发症，从而极大限制了顺铂的抗癌谱。

近四十年来，为改善细胞毒性抗肿瘤药物顺铂的治疗效果、降低其毒副作用，国内外科学家们对顺铂及其类似物的分子作用机理、细胞对DNA顺铂损伤的应答机制等进行了持续不断的探索，取得了许多影响抗肿瘤药物发现的研究成果。但是，到目前为止，基因组水平上铂类药物损伤位点的分布及其导致的基因产物(蛋白质)表达水平的变化鲜有文献报道。换言之，在基因组和蛋白质组水平上，顺铂及第二代、第三代铂基药物如何通过DNA损伤，诱导细胞凋亡和坏死，如何导致严重毒副作用的分子机理、作用网络还不清楚，导致这种基础研究的滞后成为制约新型高效、低毒抗肿瘤药物研发的瓶颈因素。

蛋白质是生理功能的执行者，是基因表达产物。因此，对损伤基因的识别研究非常重要，亟待构建能特异性识别DNA损伤的蛋白质/多肽亲和探针，采用蛋白质/多肽分离富集基因组中的DNA损伤片段，进而应用高通量测序技术检测DNA损伤在基因组水平上的分布的技术。

目前，对损伤DNA仅有较少研究，SHU Xiaoting等使用表面修饰有胺基的磁珠，通过亚胺活化羧基形成酰胺键来共价结合蛋白，构建磁珠蛋白探针，虽然对磁珠进行了封闭操作，但样品中的蛋白也有可能被结合到磁珠上，从而干扰了探针上的应答蛋白对损伤DNA的识别作用，降低了蛋白探针对损伤DNA的选择性。

发明内容

本发明的目的是为了克服现有技术存在的样品中的蛋白易结合到DNA探针上，导致蛋白探针对损伤DNA的选择性不高等问题，提供一种蛋白质功能化磁珠亲和探针及其制备方法与应用。

为了实现上述目的，本发明一方面提供一种蛋白质功能化磁珠亲和探针，该亲和探针包括表面修饰有过渡金属离子的磁性微米粒子和负载在所述磁性微米粒子表面的N末端修饰有组氨酸标签的DNA损伤应答蛋白。

本发明第二方面提供一种蛋白质功能化磁珠亲和探针的制备方法，包括：先将表面修饰有过渡金属离子的磁性微米粒子在缓冲液中孵育、分离，然后在接触体系中，将N末端修饰有组氨酸标签的DNA损伤应答蛋白与表面修饰有过渡金属离子的磁性微米粒子接触，然后将生成的DNA损伤应答蛋白-磁性微米粒子复合物进行清洗。

本发明第三方面提供一种蛋白质功能化磁珠亲和探针在捕获和/或鉴定DNA损伤中的应用。

通过上述技术方案，本发明构筑蛋白质功能化磁珠亲和探针不仅结构稳定，只需负载少量蛋白样品，而且合成简单，成本低廉。此外，本发明蛋白质功能化磁珠亲和探针在使用时只需要少量的DNA损伤片段样品，即可实现DNA损伤片段的高效捕获，而且分离快速、简单，简化了操作步骤，省时、省力。

附图说明