[发明专利]一种水禽重要疫病定量检测标准品的制备方法及应用

权利要求书

1.一种水禽重要疫病定量检测标准品的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）病毒核酸的提取和反转录:

（2）进行PCR反应，然后阳性PCR产物回收后连接pMD-18T载体，转化感受态DH5α，随后进行阳性转化菌的检测，提取阳性重组菌质粒，测定质粒浓度，以所提取的质粒10倍稀释系列制作标准曲线，标准质粒拷贝数计算公式如下： Copy Number=质量/分子量×6.02×10²³=X 6.02×10²³ / (载体长度+片段长度)/bp×10⁹×660 ；

（3）标准品建立的标准曲线

构建的阳性质粒进行10倍稀释，qPCR扩增反应后，将阳性重组质粒进行10倍系列稀释，三种质粒终浓度调整为4.39×10⁹～4.39×10 Copies/μL、4.20×10⁹～4.20×10 Copies/μL、2.91×10⁹～2.91×10 Copies/μL，共9个稀释度，以ddH2O为阴性对照，建立标准曲线，每个稀释度均设5个重复。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤（2）中，所述PCR反应的具体步骤如下：反应体系为：2× PCR buffer 12.5μL、Primer F (10 μM) 0.5μL、Primer R (10 μM)0.5 μL、cDNA或DNA 模板1-2μL、补充ddH₂O至25Μl；反应条件为：95℃30 sec，随后 95℃10 sec、58℃ 10sec、 72℃ 20 sec进行 40 Cycles，设ddH2O作为阴性对照。

3.根据权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于，步骤（3）中，所述qPCR扩增反应为：DNA 1μL、2×PCR Mix(QIAGEN) 8μL、Primer F/R各0.2μL、Probe(50pM/μL) 0.1μL、补充水至16μL，每个样品做三份平行重复检测，反应条件为：95℃2min，随后94℃10sec、59℃10sec、72℃40sec共进行40cycles，每个稀释度设5个重复。

4.根据权利要求1-3任一项所述的制备方法，其特征在于，所述核酸的提取和反转录包括DEV、DHAV、NDV，所述PCR及qPCR反应体系中的引物及探针如SEQ ID NO:1-9所示，具体如下表所示：

。

5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述PCR反应体系中，病毒为DHAV及NDV时，cDNA模板为2μL；所述病毒为DEV时，DNA模板为1μL。

6.根据权利要求1-5任一项所述的制备方法，其特征在于，当NDV模板为439 Copies/μL、DEV的模板为420 Copies/μL、DHAV的模板为291 Copies/μL时可以得到有效扩增，NDV建立的标准曲线：相关系数R2为0.999，斜率为-3.989，截距为42.045，从而得出拷贝数(X)与Ct值之间的线性关系表达式：y＝-3.989logX+42.045；DEV建立的标准曲线：相关系数R2为0.998，斜率为-3.778，截距为40.289，从而得出拷贝数(X)与Ct值之间的线性关系表达式：y＝-3.778logX+40.289；DHAV建立的标准曲线：相关系数R2为0.999，斜率为-3.954，截距为44.059，从而得出拷贝数(X)与Ct值之间的线性关系表达式：y＝-3.954logX+44.0592。

7.一种如权利要求1-6任一项所述的制备方法制备的标准品在定量确定病禽待检品中病毒的含量的试剂盒中的应用。