[发明专利]一种水禽重要疫病定量检测标准品的制备方法及应用

说明书

本发明属于生物检测技术领域，具体涉及一种水禽重要疫病定量检测标准品的制备方法及应用。具体步骤为：（1）病毒核酸的提取和反转录；（2）进行PCR反应，连接pMD‑18T载体，转化感受态DH5α，随后进行阳性转化菌的检测，提取阳性重组菌质粒，测定质粒浓度，以所提取的质粒10倍稀释系列制作标准曲线；（3）标准品建立的标准曲线。通过本发明制备的标准品，能够对水禽重要疫病定量检测，可计算待测样品模板的初始浓度，即样本中的病毒含量，适用于规模化饲养场水禽重大疫病的早期快速诊断，能给生产提供有效防治信息，及时降低上述疾病的发病率和死淘率，能够有效增加养殖户的增收，具有良好的经济效益和社会效益。

技术领域

本发明属于生物检测技术领域，具体涉及一种水禽重要疫病定量检测标准品的制备方法及应用。

背景技术

我国水禽产业包括肉鸭、蛋鸭、肉鹅等产业，每年为消费者提供大量的安全、优质、健康的肉蛋等其他附属品。危害水禽业的主要疫病包括鸭瘟、鸭病毒肝炎、鸭副黏病毒、流感、坦布苏病毒、细小病毒病等。鸭副黏病毒病又叫鸭新城疫（Newcastle Disease virus，NDV），是由鸭Ⅰ型副黏病毒引起的，可导致鸭发生消化道和呼吸道症状的传染病。鸭肠炎病毒（Duck Enteritis virus，DEV）属于疱疹病毒科疱疹病毒属，病毒粒子呈球形，直径为120～180nm，有囊膜，病毒核酸型为DNA。DEV可引起鸭、鹅等水禽的急性败血性传染病，发病率和死亡率都甚高，是危害养鸭业的最为严重的传染病之一。鸭病毒性肝炎(Duck ViralHepatitis)的病原有两种：鸭甲肝病毒（Duck Hepatitis A virus，DHAV）和星状病毒，其中DHAV分为3个血清亚型，星状病毒分为2个亚型；其中DHAV的三个血清型相互独立，无交叉免疫性。

NDV、DEV和DHAV是水禽的危害性很高的病原，经常单独或混合感染水禽，因此快速准确检测具有重要意义。现有技术中，未见制备该类病毒的标准品的相关报道。

发明内容

针对现有技术中存在的空白，本发明提供了一种水禽重要疫病定量检测标准品的制备方法。

本发明还提供了一种上述制备方法制备的标准品在定量确定病禽待检品中病毒的含量的试剂盒中的应用。

本发明为了实现上述目的所采用的技术方案为：

本发明提供了一种水禽重要疫病定量检测标准品的制备方法，包括以下步骤：

（1）病毒核酸的提取和反转录:

（2）进行PCR反应，然后阳性PCR产物回收后连接pMD-18T载体，转化感受态DH5α，随后进行阳性转化菌的检测，使用 QIAGEN 质粒提取试剂盒提取阳性重组菌质粒，测定质粒浓度，以所提取的质粒10倍稀释系列制作标准曲线，标准质粒拷贝数计算公式如下： CopyNumber=质量/分子量×6.02×10²³= X 6.02×10²³ / (载体长度+片段长度)/bp×10⁹×660；

（3）标准品建立的标准曲线

构建的阳性质粒进行10倍稀释，qPCR扩增反应后，将阳性重组质粒进行10倍系列稀释，三种质粒终浓度调整为4.39×10⁹～4.39×10 Copies/μL、4.20×10⁹～4.20×10 Copies/μL、2.91×10⁹～2.91×10 Copies/μL，共9个稀释度，以ddH2O为阴性对照，建立标准曲线，每个稀释度均设5个重复。