[发明专利]一种禽腺病毒精纯化的方法

权利要求书

1.一种禽腺病毒精纯化的方法，其特征在于，所述精纯化方法的步骤如下：

步骤1：取在细胞瓶中培养的鸡胚细胞，弃去瓶内营养液，使用无菌PBS对瓶内鸡胚细胞洗涤3次，按照每瓶1mL禽腺病毒培养液进行病毒接种，在37℃的条件下吸附1h后，弃去病毒液，加入DMEM培养基，将细胞瓶置于37℃转瓶培养箱中继续培养，接毒3d后，取出细胞瓶，反复冻融3次，收获瓶内所有的病毒细胞培养液，将培养液在4000r/min的条件下离心30min，收集上清液；按照每次所需用量进行分装，并冻存于-80℃的冰箱中；

步骤2：使用超滤膜包对步骤1所获得的上清液进行10-40倍浓缩；

步骤3：对步骤2所得液体的蛋白含量和病毒含量进行测定；

步骤4：通过G200分子筛层析填料对步骤3所得液体进行分子筛层析，并使用1-3柱体积0.1M的PBS平衡层析柱，然后将步骤3所得病毒液上样，并使用0.1M的PBS洗脱，依据280nm紫外光吸收值与时间关系图，收集病毒吸收峰的样品液，并按照步骤3的方法测定溶液中的蛋白含量与病毒含量；

步骤5：使用超滤膜包对步骤4回收的病毒液进行3-10倍浓缩，并按照步骤3的方法测定蛋白含量与病毒含量；

步骤6：使用阴离子交换层柱对步骤5所得病毒液进行层析纯化，按照步骤3的方法测定蛋白含量与病毒含量；

步骤7：使用超滤膜包对步骤6回收的病毒液进行4-10倍浓缩，得到纯化后的禽腺病毒，按照步骤3的方法测定蛋白含量与病毒含量；

所述步骤6中阴离子交换层析柱为Macro-prep High Q层析柱；

所述步骤6中使用阴离子交换层析对病毒进行纯化的具体方法如下：

使用3个柱体积的0.01M PBS溶液对Macro-prep High Q阴离子交换层析柱进行平衡；取10mL步骤5所得浓缩病毒液，并加入2mL含0.5mol/LTris的样品缓冲液稀释后进行上样，使用洗脱液对病毒进行纯化，其中洗脱液由A液、B液混合得到，A液为1.5mol/LNaCl溶液，B液为0.025mol/LTris溶液，以含25％A液、75％B液的混合液作为初始洗脱液对层析柱进行冲洗，初始洗脱液体积为2个柱体积；待初始洗脱液用完后，以4个柱体积的A液对层析柱进行冲洗；对收集到液体进行紫外检测，收集病毒吸收峰的样品液，得到纯化的病毒溶液。

2.根据权利要求1所述的禽腺病毒精纯化的方法，其特征在于，所述步骤1中鸡胚细胞为长成良好的单层CEF细胞。

3.根据权利要求1所述的禽腺病毒精纯化的方法，其特征在于，所述步骤3中蛋白含量的测定方法为：

使用超微量紫外-可见光光度计，选定A280蛋白测量法，以BSA作为内标蛋白，以0.1M的PBS作空白对照组，每个样品各测三次，记录测量所得数据。

4.根据权利要求1所述的禽腺病毒精纯化的方法，其特征在于，所述步骤3中病毒含量的测定方法为：

用灭菌的PBS溶液将收获的禽腺病毒培养液按10倍梯度稀释，取10^-5、10^-6、10^-7、10^-8的四个稀释度，每个稀释度分别接种10枚9日龄SPF鸡胚，按照每枚0.1mL病毒培养液进行病毒接种，将接种后的鸡胚置于37℃温箱中进行孵化，弃掉24h内死亡的鸡胚，在孵化至72h后分别收集各稀释度病毒培养液接种鸡胚的尿囊液，利用Reed-Muench法对病毒EID50进行计算。

5.根据权利要求1所述的禽腺病毒精纯化的方法，其特征在于，所述超滤膜包为100K的膜包。

6.根据权利要求1所述的禽腺病毒精纯化的方法，其特征在于，所述病毒吸收峰的紫外检测波长为280nm。

7.根据权利要求1所述的禽腺病毒精纯化的方法，其特征在于，所述步骤1中DMEM培养基为含1％胎牛血清的高糖DMEM培养基。

8.根据权利要求1所述的禽腺病毒精纯化的方法，其特征在于，所述精纯化的方法还包括步骤8：取纯化后的禽腺病毒按照0.5mL/管进行分装，并置于-80℃的条件下保存。