[发明专利]一种禽腺病毒精纯化的方法

说明书

本发明公开了一种禽腺病毒精纯化的方法，包括步骤如下：1.取在细胞瓶中培养的鸡胚细胞，进行病毒接种，并加入DMEM培养基，将细胞瓶置于37℃转瓶培养箱中继续培养，接毒后，收获瓶内所有的病毒细胞培养液，经离心后收集上清液；2.使用超滤膜包对步骤1所获得的上清液进行10‑40倍浓缩；3.通过G200分子筛层析填料对步骤2所得液体进行分子筛层析；4.使用超滤膜包对步骤3回收的病毒液进行3‑10倍浓缩；5.使用阴离子交换层柱对步骤4所得病毒液进行层析纯化；6.使用超滤膜包对步骤5回收的病毒液进行4‑10倍浓缩，得到纯化后的禽腺病毒。本发明的纯化方法可在保持病毒具有良好活性的前提下对病毒液中的杂蛋白进行高效纯化，方便病毒的后续生物学应用。

技术领域

本发明涉及一种病毒精纯化的方法，特别是涉及一种禽腺病毒精纯化的方法。

背景技术

近年来，禽腺病毒(FAdV)在我国禽群中具有流行范围越发广泛、禽群感染率逐级升高的趋势，由该类属病毒引起的疾病发病率呈逐年上升，且危害性不断增加。特别是由Ⅰ群禽腺病毒血清4型引起的心包积液-肝炎综合征在全国多个省份的养鸡场均有大规模暴发，造成雏鸡的大量死亡，严重影响禽类养殖的生产效率，给我国养禽业带来巨大的经济损失。由于禽腺病毒疫情不可忽视，对禽腺病毒的防控刻不容缓。

腺病毒粒子呈二十面体对称结构，无囊膜，病毒粒子直径为70～90nm。腺病毒粒子具有252个衣壳粒，其中240个非顶角衣壳粒为六邻体，12个顶角衣壳粒为五邻体，每个五邻体有两条纤维突起。目前对禽腺病毒的防控主要采用禽腺病毒灭活疫苗等，而评价疫苗免疫效果的手段主要是监测免疫禽类体内的抗体水平。国内外研究人员已报道建立了很多用于禽腺病毒抗体检测的ELISA方法，而这些研究报道均采用腺病毒的表达蛋白作为ELISA的包被抗原，但病毒在表达的过程中经过宿主修饰后，其表达蛋白的空间结构和有效抗原位点均与病毒的实际抗原位点差异巨大，造成了其检测的抗体与疫苗实际产生的抗体具有很大差异，导致检测效果的下降。为解决该问题采用全病毒作为ELISA包被抗原较为合适。

一般用于动物的病毒性疫苗多含有源于动物组织、细胞和培养基的蛋白质、糖类、脂类及核酸、以及细胞代谢副产物等杂质成分，这些物质与病毒的相互结合影响病毒的纯度及滴度，进而导致疫苗效果降低。鉴于此，本发明针对细胞源禽腺病毒，根据其分子大小和带电荷情况，针对性的去除绝大部分生物源性杂质成分，纯化富集禽腺病毒抗原成分，获得较纯的腺病毒。

发明内容

本发明提供了一种禽腺病毒精纯化的方法，以实现在不影响禽腺病毒活性的前提下对细胞源禽腺病毒进行纯化。

本发明提供了一种禽腺病毒精纯化的方法，包括步骤如下：

步骤1：取在细胞瓶中培养的鸡胚细胞，弃去瓶内营养液，使用无菌PBS对瓶内鸡胚细胞洗涤3次，按照每瓶1mL禽腺病毒培养液进行病毒接种，在37℃的条件下吸附1h后，弃去病毒液，加入DMEM培养基，将细胞瓶置于37℃转瓶培养箱中继续培养，接毒3d后，取出细胞瓶，反复冻融3次，收获瓶内所有的病毒细胞培养液，将培养液在4000r/min的条件下离心30min，收集上清液；按照每次所需用量进行分装，并冻存于-80℃的冰箱中；

步骤2：使用超滤膜包对步骤1所获得的上清液进行10-40倍浓缩；

步骤3：对步骤2所得液体的蛋白含量和病毒含量进行测定；

步骤4：通过G200分子筛层析填料对步骤3所得液体进行分子筛层析，并使用1-3柱体积0.1M的PBS平衡层析柱，然后将步骤3所得病毒液上样，并使用0.1M的PBS洗脱，依据280nm紫外光吸收值与时间关系图，收集病毒吸收峰的样品液，并按照步骤3的方法测定溶液中的蛋白含量与病毒含量；

步骤5：使用超滤膜包对步骤4回收的病毒液进行3-10倍浓缩，并按照步骤3的方法测定蛋白含量与病毒含量；

步骤6：使用阴离子交换层柱对步骤5所得病毒液进行层析纯化，按照步骤3的方法测定蛋白含量与病毒含量；