[发明专利]一种天坛株痘苗病毒的荧光标记穿梭载体及其制备方法

权利要求书

1.一种天坛株痘苗病毒的荧光标记穿梭载体，其特征在于，所述穿梭载体含有mCherry红色荧光蛋白报告基因。

2.根据权利要求1所述的一种天坛株痘苗病毒的荧光标记穿梭载体，其特征在于，编码所述mCherry的DNA序列位于天坛株痘苗病毒胸苷激酶基因TK的同源重组臂TKL和TKR之间，由P7.5启动子启动mCherry红色荧光报告基因表达，所述穿梭载体含有氨苄青霉素筛选标记和大肠杆菌复制起始位点pUC ori。

3.根据权利要求1所述的一种天坛株痘苗病毒的荧光标记穿梭载体，其特征在于，所述穿梭载体的核苷酸序列如序列1所示。

4.根据权利要求1所述的一种天坛株痘苗病毒的荧光标记穿梭载体，其特征在于，所述穿梭载体的出发载体为pMV-VTTTK，pMV-VTTTK载体包含痘苗病毒天坛株的TK基因的同源重组臂TKL和TKR。

5.根据权利要求4所述的一种天坛株痘苗病毒的荧光标记穿梭载体，其特征在于，所述pMV-VTTTK载体序列如序列2所示。

6.如权利要求1-5任一所述的一种天坛株痘苗病毒的荧光标记穿梭载体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤1，根据GenBank:AY678264.1mCherry红色荧光蛋白报告基因DNA序列，设计扩增引物，以pbI111L-mCherry质粒为模板，PCR扩增获得红色荧光蛋白报告基因完整编码序列mCherry CDS；

PCR扩增参数为：

PCR反应体系为：5×PrimerSTAR Buffer(Mg²⁺plus)10μl，dNTP Mixture 4μl，mcherryF(10μM)1μl，mcherryR(10μM)1μl，模板DNA 1μl，PrimerSTAR HS DNA Polymerase(2.5U/μl)0.5μl，加灭菌蒸馏水至50μl；

PCR反应条件为：94℃预变性2min，98℃变性10s，55℃退火15s，72℃延伸1min，循环35次；72℃延伸2min，扩增产物保存于4℃；

PCR结果：PCR产物上样电泳，mCherryCDS片段为771bp，切胶回收目的条带；

步骤2，将步骤1得到的mCherryCDS通过酶切连接方法连接至pMV-VTTTK，获得穿梭载体pMV-VTTTK-mCherry。

7.根据权利要求6所述的一种天坛株痘苗病毒的荧光标记穿梭载体的制备方法，其特征在于，所述步骤1中扩增引物为：

mcherryF:5’-CATGAATTCATGGTGAGCAAGGGCGAGGAG-3’

mcherryR:5’-CATGGATCCTTACTTGTACAGCTCGTCCAT-3’。

8.根据权利要求6所述的一种天坛株痘苗病毒的荧光标记穿梭载体的制备方法，其特征在于，所述步骤1中mCherry CDS基因完整编码序列如序列3所示。

9.根据权利要求6所述的一种天坛株痘苗病毒的荧光标记穿梭载体的制备方法，其特征在于，所述步骤2中酶切连接方法具体为：

用限制性内切酶EcoRI和BamHI对mCherryCDS片段进行双酶切，与经过同样双酶切的pMV-VTTTK质粒通过T4连接酶进行连接，得到质粒pMV-VTTTK-mCherry。

10.一种天坛株痘苗病毒的荧光标记穿梭载体在制备去除天坛株痘苗病毒TK基因的重组痘苗病毒作为作为活病毒载体疫苗及亚单位疫苗制备及生物制药中的应用。