[发明专利]一种天坛株痘苗病毒的荧光标记穿梭载体及其制备方法

说明书

本发明公开的一种天坛株痘苗病毒的荧光标记穿梭载体，穿梭载体含有mCherry红色荧光蛋白报告基因，编码mCherry的DNA序列位于天坛株痘苗病毒胸苷激酶基因TK的同源重组臂TKL和TKR之间，由P7.5启动子启动mCherry红色荧光报告基因表达，穿梭载体含有氨苄青霉素筛选标记和大肠杆菌复制起始位点pUC ori。本发明以mCherry红色荧光蛋白基因为报告基因可用于筛选重组痘苗病毒，重组病毒感染肿瘤动物模型后可作为特异性分子探针成为追踪靶目标并实现小动物活体成像；同时可提高痘苗病毒的肿瘤细胞选择性。

技术领域

本发明属于生物基因工程技术领域，具体涉及一种天坛株痘苗病毒的荧光标记穿梭载体，本发明还涉及一种天坛株痘苗病毒的荧光标记穿梭载体的制备方法。

背景技术

肿瘤生物治疗技术是近年来兴起的一种全新的肿瘤治疗手段，具有副作用小、抗肿瘤活性高、适应性广等特点。将生物技术用于肿瘤治疗，既可靶向性地杀伤肿瘤细胞同时降低对正常细胞和组织的损害，是改变和提高患者自身机体免疫功能的治本方法，为最终攻克肿瘤带来希望，其应用前景广阔。

痘苗病毒作为第一个成功应用于人类的疫苗，引起了长时间普遍的关注和研究。痘苗病毒具有许多理想的生物治疗载体属性，使其有可能成为疫苗和溶瘤病毒的优良载体。痘苗病毒能够选择性地感染肿瘤细胞，并在其中复制，最终使肿瘤细胞裂解。胸苷激酶TK为痘苗病毒DNA复制所必需，正常细胞中TK浓度较低，不足以供TK去除的痘苗病毒复制；而肿瘤细胞DNA代谢旺盛，有较高浓度的TK存在，所以TK去除的痘苗病毒更倾向于在肿瘤细胞中复制，这已在包括结肠癌、黑素瘤、肉瘤等在内的多种肿瘤细胞中得到证实。

活体生物荧光成像技术是近年来发展起来的一项分子、基因表达的分析检测技术。研究人员能够直接监控活体生物体内肿瘤的生长及转移、特定基因的表达等生物学过程。因其不需要宰杀动物、操作简单、所得结果直观、灵敏度高等特点，已广泛应用于生命科学、医学研究及药物开发等领域。在所有的红色荧光蛋白中mCherry应用广泛，mCherry是一种来自于蘑菇珊瑚(mushroom coral)的红色荧光蛋白，常用于标记细胞或者分子，进行示踪实验。相对于其他荧光，mCherry的好处在于它的颜色和应用最多的绿色荧光蛋白(GFP)能进行共同标记，并且mCherry相对于其他单体荧光蛋白来说也具有卓越的光稳定型，mCherry的最大吸收/发射峰分别位于587nm和610nm，对光致漂白耐受，荧光非常稳定。

发明内容

本发明的目的是提供一种天坛株痘苗病毒的荧光标记穿梭载体，用于制备重组痘苗病毒，利用活体生物荧光成像技术动态监测重组病毒在肿瘤动物模型中的全身分布和在靶组织中的复制情况。

本发明的目的是提供一种天坛株痘苗病毒的荧光标记穿梭载体的制备方法。

本发明所采用的第一个技术方案是，一种天坛株痘苗病毒的荧光标记穿梭载体，穿梭载体含有mCherry红色荧光蛋白报告基因。

本发明的特征在于，

编码mCherry的DNA序列位于天坛株痘苗病毒胸苷激酶基因TK的同源重组臂TKL和TKR之间，由P7.5启动子启动mCherry红色荧光报告基因表达，穿梭载体含有氨苄青霉素筛选标记和大肠杆菌复制起始位点pUC ori。

穿梭载体的核苷酸序列如序列1所示。

穿梭载体的出发载体为pMV-VTTTK，pMV-VTTTK载体包含痘苗病毒天坛株的TK基因的同源重组臂TKL和TKR。

pMV-VTTTK载体序列如序列2所示。

本发明所采用的第二个技术方案是，一种天坛株痘苗病毒的荧光标记穿梭载体的制备方法，包括以下步骤：