[发明专利]一种利用微生物合成对羟基苯甲酸的方法

权利要求书

1.一种利用微生物合成对羟基苯甲酸的方法，其特征在于包括如下步骤：

步骤1：Gongronella sp.w5发酵液的制备

1a、菌种活化：在无菌条件下，从菌株Gongronella sp.w5保藏斜面上划出一菌块接种于固体CPDA培养基上，于28℃生化培养箱中培养5天；

1b、种子液制备：在无菌条件下，从1a培养好的固体培养基上铲划出四块菌块转接到装有100mLⅥ液体培养基的250mL三角瓶中，28℃、120rpm摇床中进行培养4天，获得的发酵产物作为种子液；

1c、发酵：将1b获得的种子液匀浆打碎，匀浆液按2.5％的体积比接种到装有400mLⅥ液体培养基的1L三角瓶中，37℃、120rpm摇床中培养3天，收集发酵液50L；

步骤2：Gongronella sp.w5发酵液粗提物的制备

将步骤1收集的50L发酵液用等体积的乙酸乙酯萃取，合并萃取液，旋蒸浓缩除去溶剂，获得粗提物浸膏；

步骤3：粗提物的分离

将步骤2获得的粗提物浸膏用甲醇溶解，0.22μm滤膜过滤，上硅胶柱进行粗分离，梯度洗脱后得到组分4；

步骤4：组分4的分离纯化

将步骤3获得的组分4过ODS反相柱，进行梯度洗脱，获得对羟基苯甲酸；

步骤1中，所述固体CPDA培养基以1L计组成如下：200g土豆滤出液、20g葡萄糖、3.0g磷酸二氢钾、1.5g七水硫酸镁、0.04g维生素B₁以及15g琼脂粉混合均匀后于115℃灭菌30min后获得；

步骤1中，所述Ⅵ液体培养基以1L计组成如下：15g蔗糖、1.5g DL-天冬酰胺、1.0g磷酸二氢钾、0.5g七水硫酸镁、0.1g十二水磷酸氢二钠、0.01g氯化钙、0.01g七水硫酸亚铁、2mg硫酸锌、2mg五水硫酸铜、0.05mg维生素B1以及28mg腺苷酸混合均匀后于115℃灭菌30min后获得；

步骤1中，所述菌株Gongronella sp.w5是从土壤中分离获得，该菌已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号CCTCC NO：M 2017787。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：

所述土豆滤出液是由200g土豆加400mL蒸馏水煮沸30min后过滤获得。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：

步骤3中，梯度洗脱的洗脱参数为：

设置四个洗脱梯度，洗脱液由二氯甲烷和甲醇按照体积比分别为100:1、100:2、100:4、100:8构成，每个梯度洗脱两个柱体积，每100mL为一个流份收集，通过薄层层析检测，相同部分进行合并，得到组分4。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：

步骤3中硅胶柱进行粗分离的过程具体包括如下步骤：

3a、拌样：将粗提物浸膏和硅胶按1:2的比例进行拌样，自然风干后，研磨成细粉末状待用；

3b、装柱：称10-50倍于上样量的干硅胶，加入干硅胶体积一倍的二氯甲烷，用玻璃棒充分搅拌成匀浆后，倒入晾干的玻璃柱中，装上蓄液球，打开柱下活塞，使其自然沉降，将沾于壁上的硅胶用起始洗脱剂轻轻冲洗下去；

3c、压实：沉降完成后，添加更多的二氯甲烷，直至柱床压实；

3d、上样：将以上拌好样的样品缓缓加到压实的硅胶柱上，沿壁缓缓加入一些二氯甲烷，再将一团脱脂棉塞至接近硅胶上表面，以防止续液时硅胶表面被砸坑；

3e、过柱和收集：以二氯甲烷和甲醇混合液进行梯度洗脱，每个梯度冲两个柱体积，每100mL为一个流份收集，通过薄层层析进行检测，相同部分进行合并，得到组分4。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：

步骤3e中，梯度洗脱时设置四个洗脱梯度，洗脱液由二氯甲烷和甲醇按体积比100:1、100:2、100:4、100:8的比例混合构成。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：

步骤4中，梯度洗脱的洗脱参数为：

设置三个洗脱梯度，洗脱液分别为10vt％、15vt％、20vt％的甲醇水溶液，每个梯度洗脱两个柱体积，每100mL收集一个流份，通过薄层层析检测，相同流份进行合并，低温浓缩除去溶剂，即可获得对羟基苯甲酸。