[发明专利]一种利用微生物合成对羟基苯甲酸的方法

说明书

本发明公开了一种利用微生物合成对羟基苯甲酸的方法，以一株土壤来源的真菌菌株Gongronella sp.w5为生产菌，从其发酵液中提取分离获得对羟基苯甲酸。与化学合成法相比，整个反应过程是在常温常压下进行的，污染小、能耗小，并且制备方法简单，不需要酚类物质作为原料；本发明目标产物纯度大于98％。

技术领域

本发明涉及一种利用微生物合成对羟基苯甲酸的方法。

背景技术

对羟基苯甲酸(p-Hydroxybenzoic acid)是一种具有多种用途的有机合成原料，其酯类物质的合成，已在食品药品的防腐杀菌、香精工业、医药合成和农业等领域得到广泛应用。防腐剂方面，对羟基苯甲酸酯(尼泊金酯)是普遍被认可的无刺激安全的化妆品防腐剂；作为食品添加剂，可用于酱油、醋、饮料、果品调味剂、果蔬和腌制品等；亦可用于医药的防腐、防霉和杀菌，是目前应用最广泛的防腐剂之一。香精工业方面，对羟基苯甲酸可用于合成对茴香酸，其酯类呈淡淡的水果及茴香香气，等同天然香料，用于各种香精的配制。药物合成方面，对羟基苯甲酸可用于许多重要药物的合成原料，包括治疗痛风的非布索坦、具有调脂作用的非诺贝特、抗心律失常药胺碘酮和脑功能改善药茴拉西坦等药物的合成。农药合成方面，对羟基苯甲酸可用于除草剂溴苯腈和碘苯腈、杀虫剂杀螟腈和苯腈磷的合成。此外，对羟基苯甲酸还可用于紫外线吸收剂、热敏染料显色剂、彩色胶片、液晶聚合物和塑料的合成。

对羟基苯甲酸的生产方法多种多样，化学法如水杨酸钾加热制取、苯酚钾羧化法、又或者是由异丙苯合成苯酚后，再经高温高压的Kolbe-Schmitt反应合成。其合成工艺存在能源消耗大、成本高、产率低等问题，并且合成途径中产生的苯酚对环境有较大污染。从天然植物中提取，则存在周期长、收率低等缺点。

发明内容

本发明是为了避免上述现有技术所存在的不足之处，旨在提供一种利用微生物合成对羟基苯甲酸的方法。本发明以一株土壤来源的真菌菌株Gongronella sp.w5为生产菌，从其发酵液中提取分离获得对羟基苯甲酸。该微生物合成法可以在常温常压下进行、并且具有绿色高效等优点。

本发明利用微生物合成对羟基苯甲酸的方法，包括如下步骤：

步骤1：Gongronella sp.w5发酵液的制备

1a、菌种活化：在无菌条件下，从菌株Gongronella sp.w5保藏斜面上划出一小菌块(1cm×1cm)接种于固体CPDA培养基上，于28℃生化培养箱中培养5天；

1b、种子液制备：在无菌条件下，从1a培养好的固体培养基上铲划出四块菌块(1cm×1cm)转接到装有100mLⅥ液体培养基的250mL三角瓶中，28℃、120rpm摇床中进行培养4天，获得的发酵产物作为种子液；

1c、发酵：将1b获得的种子液匀浆打碎，匀浆液按2.5％(V/V)的比例接种到装有400mLⅥ液体培养基的1L三角瓶中，37℃、120rpm摇床中培养3天，收集发酵液50L；

步骤2：Gongronella sp.w5发酵液粗提物的制备

将步骤1收集的50L发酵液用等体积的乙酸乙酯萃取，合并萃取液，旋蒸浓缩除去溶剂，获得粗提物浸膏；

步骤3：粗提物的分离

将步骤2获得的粗提物浸膏用甲醇溶解，0.22μm滤膜过滤，上硅胶柱进行粗分离，梯度洗脱后得到组分4；

步骤4：组分4的分离纯化

将步骤3获得的组分4过ODS反相柱，进行梯度洗脱，获得对羟基苯甲酸(w5-4)。