[发明专利]用于cfDNA建库的接头、引物组、试剂盒和建库方法

说明书

本发明公开了用于cfDNA建库的接头、引物组、试剂盒和建库方法，其中，接头包括顶部接头和底部接头，分别为SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示；引物组包括SEQ ID NO:4‑6所示的序列；试剂盒包括上述接头和引物组；cfDNA建库的方法包括：(1)将cfDNA进行末端修复，并在cfDNA的3’端添加A碱基；(2)将cfDNA末端连接上接头得到连接产物；(3)对连接产物进行第一轮扩增，并对产物进行磁珠纯化；(4)对磁珠纯化后的第一轮扩增产物进行建库扩增，产物磁珠纯化后，得到高通量测序文库。利用该接头和cfDNA建库方法获得的文库，适用于Illumina测序平台，并可以提高文库转化效率。

技术领域

本发明涉及分子基因学技术领域，特别是指用于cfDNA建库的接头、引物组、试剂盒和建库方法。

背景技术

血浆游离DNA(Plasma cell-free DNA，cfDNA)是存在于人体血液中一种无细胞状态的胞外DNA，在人体的尿液、脑脊液、支气管肺泡灌洗液、羊水和精液等体液和体外细胞培养液当中也可检出一定量的cfDNA。自1947年由Mandel和Metais发现cfDNA以来，随着分子检测技术的飞速发展，血浆游离DNA现已被检测到已有300多种，且观察到与肿瘤细胞DNA相同的基因突变，使得cfDNA作为标记物应用于临床疾病的诊断、预后、检测等有潜在价值。近年来cfDNA检测已用于多种急性或慢性疾病的诊断和预后评价中。

如今，人们通常利用新一代测序(NGS)技术对cfDNA进行高通量分析，看看哪些基因有突变，并根据突变信息来确定下一步的诊疗方案。NGS技术以Illumina公司的Hiseq和Nextseq测序仪为代表的第二代测序技术，具有检测通量高(每次运行可以产生上百G的基因数据)，覆盖面广(可以进行人类全基因组的测序分析)，性价比高(平均每G成本仅需几十块钱)等优点，因此特别适用于多个基因的多种突变类型的并行检测。但是NGS技术首先需要对DNA进行文库构建，在现有的文库构建过程中，步骤繁琐，需要经过多次纯化过程，会造成DNA的损失，同时在接头连接的过程中会出现接头自连现象，致使文库构建效率低、质量差。或者通过末端修复并加A后纯化、连接头后纯化、扩增、纯化等步骤来完成。虽然减少了纯化步骤，降低DNA的损耗，但是仍然是接头自连的问题难以解决。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提出指用于cfDNA建库的接头、引物组、试剂盒和建库方法，本发明的方法能够有效排除建库过程中PCR反应引入的随机突变，排除假阳性，极大地提高了NGS数据分析的准确度。

基于上述目的，本发明提供的一种用于cfDNA建库的接头，其特征在于，所述接头为双链接头，包括顶部接头和底部接头，所述顶部接头的序列为：5’-ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTNNNNNNNNNNNNGCCGCCGCCGCCG*T-3’，其为SEQ ID NO:1所示；所述底部接头的序列为：5’-P-CGGCGGCGGCGGC-3’，其为SEQ ID NO:2所示，5’端进行磷酸化；其中顶部接头中12个碱基“NNNNNNNNNNNN”为标签序列。

本发明设计了一种特殊的接头(如图1所示)，接头的3’端(绿色)是一段高GC含量的固定片段，突出的T用于和被修复的带A的cfDNA连接；接头的中间是12个碱基(黄色)随机单分子标签序列，此标签可实现对所有起始建库模板核酸片段进行标记，以有效排除建库过程中PCR反应引入的随机突变，排除假阳性，极大地提高了NGS数据分析的准确度；接头的5’端是建库P5引物的部分序列(紫色)，在cfDNA和接头连接后，可直接以该序列为上游非特异引物、含有P7序列的fusion gene的特异下游引物进行多重PCR，获得的目的片段进行扩增建库。