[发明专利]一种鸟类多瘤病毒PCR诊断试剂盒及其检测方法

权利要求书

1.一种鸟类多瘤病毒PCR诊断试剂盒，其特征在于，包括：裂解液、扩增反应混合液、阴性对照和阳性对照；其中，所述裂解液的成分为DNAiso Reagent；所述扩增反应混合液包含灭菌三蒸水、PCR Buffer、dNTP、APV-F上游引物、APV-R下游引物和rTaq DNA聚合酶；所述阴性对照为灭菌三蒸水；所述阳性对照为鸟类多瘤病毒阳性质粒。

2.根据权利要求1所述的鸟类多瘤病毒PCR诊断试剂盒，其特征在于，所述APV-F上游引物的序列为：5’-GTATGTATGACCCATAGAA-3’，所述APV-R下游引物的序列为：5’-GCAGCAGGAGAAGCCTCAGGG-3’。

3.根据权利要求1所述的鸟类多瘤病毒PCR诊断试剂盒，其特征在于，所述裂解液的成分为DNAiso Reagent，20个反应共计20mL，装成1瓶；所述扩增反应混合液包含灭菌三蒸水、10×PCR Buffer、2.5mmol·L^-1dNTP、25μmol·L^-1APV-F上游引物、25μmol·L^-1APV-R下游引物和5U/μL rTaq DNA聚合酶，每个反应体积比为17.0︰2.5︰2︰0.5︰0.5︰0.5，共计23μL，20个反应共计460μL，装成1管；所述阴性对照为灭菌三蒸水，20个反应共计2.0mL，装成1瓶；所述阳性对照为鸟类多瘤病毒阳性质粒，20个反应共计40.0μL，装成1管。

4.根据权利要求1所述的鸟类多瘤病毒PCR诊断试剂盒，其特征在于，所述鸟类多瘤病毒为鹦鹉鸟类多瘤病毒。

5.一种鸟类多瘤病毒PCR诊断试剂盒的检测方法，其特征在于，包括以下检测步骤：

步骤1，DNA提取

子步骤1.1，待检样品DNA提取：吸取待检样品置入无菌离心管，加入裂解液，颠倒混匀，静置裂解，加入无水乙醇，颠倒混匀，静置沉淀，离心，弃去上清液，洗涤，弃去洗涤液，倒置无菌离心管，在空气中自然干燥，用NaOH溶解，得待检样品DNA提取液；

子步骤1.2，阴性对照样品提取：吸取灭菌三蒸水置入无菌离心管，加入裂解液，颠倒混匀，静置裂解，加入无水乙醇，颠倒混匀，静置沉淀，离心，弃去上清液，洗涤，弃去洗涤液，倒置无菌离心管，在空气中自然干燥，用NaOH溶解，得阴性对照样品提取液；

步骤2，PCR扩增反应

子步骤2.1，待检样品PCR扩增反应：取扩增反应混合液，加入所述待检样品DNA提取液，混合均匀，进行PCR扩增反应，所述PCR扩增反应的条件依次为95℃预变性反应5min、94℃反应30s、54℃反应40s、72℃反应40s，共进行多个循环，最后再在72℃反应10min，得待检样品PCR扩增产物；

子步骤2.2，阴性对照样品PCR扩增反应：取扩增反应混合液，加入所述阴性对照样品提取液，混合均匀，进行PCR扩增反应，所述PCR扩增反应的条件依次为95℃预变性反应5min、94℃反应30s、54℃反应40s、72℃反应40s，共进行多个循环，最后再在72℃反应10min，得阴性对照样品PCR扩增产物；

子步骤2.3，阳性对照样品PCR扩增反应：取扩增反应混合液，加入鸟类多瘤病毒阳性质粒，混合均匀，进行PCR扩增反应，所述PCR扩增反应的条件依次为95℃预变性反应5min、94℃反应30s、54℃反应40s、72℃反应40s，共进行多个循环，最后在72℃反应10min，得阳性对照样品PCR扩增产物；

步骤3，电泳检测

通过琼脂糖凝胶电泳分别对所述待检样品PCR扩增产物、阴性对照样品PCR扩增产物和阳性对照样品PCR扩增产物进行电泳检测，并进行判断。

6.根据权利要求5所述的鸟类多瘤病毒PCR诊断试剂盒的检测方法，其特征在于，步骤2中，所述扩增反应混合液包含灭菌三蒸水、PCR Buffer、dNTP、APV-F上游引物、APV-R下游引物和rTaq DNA聚合酶。