[发明专利]一种鸟类多瘤病毒PCR诊断试剂盒及其检测方法

说明书

本发明提供了一种鸟类多瘤病毒PCR诊断试剂盒及其检测方法，该鸟类多瘤病毒PCR诊断试剂盒，包括：裂解液、扩增反应混合液、阴性对照和阳性对照；其中，所述裂解液的成分为DNAiso Reagent；所述扩增反应混合液包含灭菌三蒸水、PCR Buffer、dNTP、APV‑F上游引物、APV‑R下游引物和rTaq DNA聚合酶；所述阴性对照为灭菌三蒸水；所述阳性对照为鸟类多瘤病毒阳性质粒。该试剂盒灵敏度高、特异性好、稳定性高、结果直观，其检测方法易于操作、方便快捷，能大幅缩短检测时间，为临床控制鸟类多瘤病毒感染提供有力的技术手段，尤其在鹦鹉鸟类多瘤病毒感染快速诊断方面有重要作用。

技术领域

本发明涉及动物医学动物疫病分子生物学诊断技术领域，具体涉及一种鸟类多瘤病毒PCR诊断试剂盒及其检测方法。

背景技术

鸟类多瘤病毒(Avian Polyoma Virus，APV)首先在虎皮鹦鹉感染病例中发现，又名法兰西斯掉羽症。感染的虎皮鹦鹉主要症状是腹部及背部长不出绒羽。后来又陆续发现金刚鹦鹉、锥尾鹦鹉、月轮、凯克、爱情鸟、吸蜜鹦鹉、亚马逊鹦鹉、灰鹦、鹰头、及巴丹等鹦鹉亦可感染，成为鹦鹉的一种重要病原。

APV为多瘤病毒属(Polyomavirus)，多瘤病毒科(Polyomaviridae)成员，20面体对称，环状双股DNA。病毒在患病鹦鹉的血液、羽屑、粪便、嗉囊分泌物中均可发现，其中羽屑为最重要的散布来源。幼龄鹦鹉发病死亡率高达30％～100％。5-16周龄感染出现厌食、精神沉郁、下痢、麻痹、嗉囊排空时间延长、呕吐、皮下出血等临床症状。由于本病对鹦鹉危害极大，羽毛发育不良严重影响鹦鹉的观赏性，因此是鹦鹉需要着重预防和检疫的传染病。目前，缺乏诊断技术对鸟类多瘤病毒感染进行快速诊断，无法快速控制疫情。

发明内容

针对现有技术中存在的问题，本发明的目的在于提供一种鸟类多瘤病毒PCR诊断试剂盒及其检测方法，该试剂盒灵敏度高、特异性好、稳定性高、结果直观，其检测方法易于操作、方便快捷，能大幅缩短检测时间，为临床控制鸟类多瘤病毒感染提供有力的技术手段，尤其在鹦鹉鸟类多瘤病毒感染快速诊断方面有重要作用。

为了达到上述目的，本发明采用以下技术方案予以实现。

(一)一种鸟类多瘤病毒PCR诊断试剂盒，包括：裂解液、扩增反应混合液、阴性对照和阳性对照；其中，所述裂解液的成分为DNAiso Reagent；所述扩增反应混合液包含灭菌三蒸水、PCR Buffer、dNTP、APV-F上游引物、APV-R下游引物和rTaq DNA聚合酶；所述阴性对照为灭菌三蒸水；所述阳性对照为鸟类多瘤病毒阳性质粒。

优选的，所述APV-F上游引物的序列为：5’-GTATGTATGACCCATAGAA-3’，所述APV-R下游引物的序列为：5’-GCAGCAGGAGAAGCCTCAGGG-3’。

优选的，所述裂解液的成分为DNAiso Reagent，20个反应共计20mL，装成1瓶；所述扩增反应混合液包含灭菌三蒸水、10×PCR Buffer、2.5mmol·L^-1dNTP、25μmol·L^-1APV-F上游引物、25μmol·L^-1APV-R下游引物和5U/μL rTaq DNA聚合酶，每个反应体积比为17.0︰2.5︰2︰0.5︰0.5︰0.5，共计23μL，20个反应共计460μL，装成1管；所述阴性对照为灭菌三蒸水，20个反应共计2.0mL，装成1瓶；所述阳性对照为鸟类多瘤病毒阳性质粒，20个反应共计40.0μL，装成1管。

优选的，所述鸟类多瘤病毒为鹦鹉鸟类多瘤病毒。

(二)一种鸟类多瘤病毒PCR诊断试剂盒的检测方法，包括以下检测步骤：

步骤1，DNA提取