[发明专利]一种制备羊梭菌病基因工程亚单位疫苗的方法

权利要求书

1.一种制备羊三联四防基因重组亚单位疫苗的方法，通过原核表达相关毒素蛋白，和佐剂配成疫苗，接种免疫实验动物进行效果评价，其特征在于通过以下步骤完成:

1)分别克隆产气荚膜梭菌α毒素蛋白基因，腐败梭菌α毒素蛋白基因，产气荚膜梭菌β1毒素蛋白基因，产气荚膜梭菌ε毒素蛋白基因，以上毒素抗原N端分别携带flagellin、flagellin、invasin和padre佐剂并克隆至表达载体pVEXK-HN-MBP-MCS-K6EE-His，得到四种重组表达质粒：

pVEXK-HN-fMBP-TEV-flagellin-CPA-K6EE-HIS；

pVEXKHN-fMBP-TEV-INVASIN-CPB-K6EE-HIS；

pVEXK-HN-fMBP-TEV-flagellin-CSA-K6EE-HIS；

pVEXK-HN-ptMBP-TEV-PADRE-ETX106-K6EE-HIS；

所述的步骤1)中产气荚膜梭菌α毒素蛋白基因序列为序列表中的SEQ ID NO:1，其对应的产气荚膜梭菌α毒素氨基酸序列为SEQ ID NO:2；

所述的步骤1)中产气荚膜梭菌β1毒素蛋白基因为序列表中的SEQ ID NO:3，其对应的产气荚膜梭菌βl毒素氨基酸序列为SEQ ID NO:4；

所述的步骤1)中腐败梭菌α毒素蛋白基因序列为序列表中的SEQ ID NO:5，其对应的腐败梭菌α毒素氨基酸序列为SEQ ID NO:6；

所述的步骤1)产气荚膜梭菌ε毒素蛋白基因序列为序列表中的SEQ ID NO:7，其对应的产气荚膜梭菌ε毒素氨基酸序列为SEQ ID NO:8；

所述的步骤1)中Flagellin佐剂基因序列为序列表中的SEQ ID NO:9,其对应的Flagellin短肽佐剂氨基酸序列SEQ ID NO:10；

所述的步骤1)中Invasin短肽佐剂基因序列为序列表中的SEQ ID NO:11,其对应的Invasin短肽佐剂氨基酸序列SEQ ID NO:12；

所述的步骤1)中PADRE短肽佐剂基因序列为序列表中的SEQ ID NO:13,其对应的PADRE短肽佐剂氨基酸序列SEQ ID NO:14；

所述的步骤1)中TEV裂解位点基因序列为序列表中的SEQ ID NO:15,其对应的TEV裂解位点氨基酸序列SEQ ID NO:16；

所述的步骤1)中佐剂序列均位于重组蛋白的氨基端；

2)将构建好的4个重组质粒载体分别转化低内毒素大肠杆菌表达菌株ClearColi®BL21(DE3)，获得基因工程菌株；

3)将基因工程菌株，接种于LB培养基中诱导培养，将培养后的工程菌使用高压均质机破菌，离心分离上清，使用亲和纯化方法纯化目的蛋白；

4)纯化后的几种目的蛋白使用TritonX-114处理内毒素并过滤除菌，保存于适当缓冲液；

5)使用内标法进行重组蛋白定量；

6)按照1:1:1:1的比例混合4种重组蛋白并与佐剂等体积乳化配苗；

7)将配好的疫苗免疫家兔进行安全性评价检测；

8)将配好的疫苗免疫家兔一段时间后采血分离血清，取分离的血清分别和不同剂量4种野生型毒素进行中和实验，后注射小鼠，观察小鼠存活情况，评价疫苗效力。

2.根据权利要求1中的方法，其特征在于，所述的步骤7)中安全性评价检测包括一次单剂

量安全试验、单剂量重复接种试验以及一次超剂量安全试验。

3.一种羊三联四防基因重组亚单位疫苗，其特在在于，所述疫苗由权利要求1-2中任意

一项方法制备得到。