[发明专利]一种制备羊梭菌病基因工程亚单位疫苗的方法

说明书

本发明提供了一种有效制备羊梭菌病基因重组亚单位疫苗的方法。本发明使用基因优化后的重组蛋白，避免了野生型可溶性毒素蛋白对动物的毒性，不需要经过重组蛋白的灭活，在保证了疫苗抗原安全性的同时，尽可能地保证了疫苗抗原的最大免疫原性。

技术领域

本发明涉及的是生物医药技术领域，特别是涉及一种兽用基因重组亚单位疫苗的制备方法。

背景技术

羊梭菌性疾病是由梭状芽胞杆菌属中的微生物所致的一类疾病。包括羊快疫、羊肠毒血症、羊猝狙、羔羊痢疾、坏死性肠炎等；本菌致病作用主要在于梭菌所产生的毒素，其中产气荚膜梭菌α、β、ε和毒素及腐败梭菌α毒素是主要的致死毒素。

目前梭菌性疾病的免疫，主要是通过灭活梭菌培养过程中所产的毒素而实现，毒素为疫苗的主要有效免疫抗原，所制备的疫苗属于传统疫苗类型，基本都是脱毒后通过皮下或者肌肉注射免疫动物，虽然对该病的流行具有较好的控制作用，但是接种后免疫副反应重，并且容易造成注射部位肌肉质量下降，带来一定的经济损失，且由于培养此类灭活疫苗的相关试剂、培养基等成本也较高，工艺复杂，质量稳定性也不易控制。

基因工程亚单位疫苗以其抗原组分单一、纯度高，免疫反应性强，接种后可刺激机体产生特异性免疫应答，节约机体免疫资源，可实现规模化生产等优势逐步成为越来越多研究者关注的焦点。

研究发现，通过大肠杆菌基因工程的方法表达的可溶性α毒素、β毒素和ε毒素都具很强的毒性，而经过常规脱毒处理后的蛋白免疫原性又会有所降低。另外，实现大肠杆菌大量表达可溶性毒素、稳定保存所表达的基因重组毒素蛋白及保证疫苗的安全性也是目前的技术难点。因此本专利中所用毒素均为截短或突变型毒素，以上截短或突变体已被文献证明具有高度安全性，同时保留了毒素本身的免疫原性。

发明内容

本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供了一种有效制备羊梭菌病基因重组亚单位疫苗的方法。

本发明具体通过以下所采用的技术方案来实现：

1. 分别克隆优化后的产气荚膜梭菌α毒素蛋白基因，腐败梭菌α毒素蛋白基因，产气荚膜梭菌β1毒素蛋白基因，产气荚膜梭菌ε毒素蛋白基因及Flagellin佐剂蛋白基因，使用融合PCR技术，在产气荚膜梭菌α毒素蛋白基因前融合Flagellin，在腐败梭菌α毒素蛋白基因前融合Flagellin，在产气荚膜梭菌β1毒素蛋白基因前融合Invasin短肽佐剂， 在产气荚膜梭菌ε毒素蛋白基因前融合PADRE短肽佐剂，与大肠杆菌表达载体相连，构建相应的四个大肠杆菌重组质粒载体，分别命名为pVEXK-HN-fMBP-TEV-flagellin-CPA-K6EE-HIS 、pVEXK-HN-fMBP-TEV-INVASIN-CPB-K6EE-HIS 、pVEXK-HN-fMBP-TEV-flagellin-CSA-K6EE-HIS 、pVEXK-HN-ptMBP-TEV-PADRE-ETX106-K6EE-HIS (图1 B)；

2. 将构建好的4个重组质粒载体分别转化大肠杆菌表达菌株ClearColi® BL21(DE3) ，获得基因工程菌株；

3. 将基因工程菌株，接种于LB培养基中诱导培养，将培养后的工程菌使用均质机破菌，离心分离上清，使用亲和纯化方法纯化目的蛋白；

4.纯化后的几种目的蛋白（fMBP-TEV-Flagellin-CPA-K6ee-his、fMBP-TEV-Invasin-CPB-K6ee-his、fMBP-TEV-Flagellin-CSA-K6ee-his和fMBP-TEV-PADRE-ETX106 -K6ee-his）使用TritonX-114 处理内毒素并过滤除菌，使用鲎试剂检测内毒素含量，保证内毒素含量小于500 EU/ml以下，后将重组蛋白保存于适当缓冲液；

5. 使用内标法进行重组蛋白定量；

6. 按照一定的比例混合4种重组蛋白并和佐剂乳化配苗；