[发明专利]一种用于副猪嗜血杆菌分子分型的全基因组测序方法

说明书

本发明公开了一种用于副猪嗜血杆菌分子分型的全基因组测序方法。该方法通过全基因组序列在副猪嗜血杆菌MLST分型数据库中找到7个看家基因（rpoB、atpD、g3pd、infB、mdh、_6pgd、frdB），并确定看家基因的等位基因号及序列型，包括样品预处理、提取基因组DNA、质量检测与测序，采用DNAMAN软件对测序结果进行多序列比对与分析，获得菌株序列型（ST）。同时发现了3个新的等位基因及两株副猪嗜血杆菌ST型均为新型。该技术流程可以用于副猪嗜血杆菌分类鉴定和遗传多样性研究。

技术领域

本发明涉及一种动物病原菌分子分型技术，具体涉及一种基于全基因组测序用多位点序列分型(MLST)技术对副猪嗜血杆菌(Haemophilus Parasuis)进行分型的方法。

背景技术

副猪嗜血杆菌(Haemophilus parasuis strains,HPS)是巴氏杆菌科的一种短小革兰氏阴性菌，主要危害仔猪和青年猪。该病菌是猪上呼吸道的一种常在细菌，在特定条件下可以侵入机体引起严重的全身性疾病，其主要特征是以纤维素性多发性浆膜炎、关节炎和脑膜炎为主，该病原引起的疾病又被称为“革拉氏病”。

目前，副猪嗜血杆菌病在我国乃至全世界广泛流性，给养猪业带来严重的经济损失，是世界性病害之一，已引起人们广泛的关注。此外，副猪嗜血杆菌极易产生耐药性，且血清型众多，每个血清型之间缺乏免疫交叉性，因此至今仍没有一个很好的控制副猪嗜血杆菌病流行的方法。

全基因组测序，即对一种生物的基因组中的全部基因进行测序，测定其DNA的碱基序列。全基因组测序覆盖面广，能检测个体基因组中的全部遗传信息；准确性高，其准确率可高达99.99％。随着基因组测序技术的进步，基于全基因组序列的分型分析技术更为全面的提供了病原细菌的海量信息，对于病原细菌的鉴定非常有效。准确而高分辨率的分型信息为流行病学变化以及扩散范围的检测与预警奠定了基础，同时也为临床诊断提供了依据。然而，分辨率不高严重影响了基于看家基因一代测序结果对临床菌株的诊断。而全基因组测序就目前来说费用还较高，计算和分析方法还需要进一步完善，用于日常监测的可行性还较低。

多位点序列分型(MLST)技术是直接利用5—10个看家基因的核普酸序列片段之间的碱基差异进行分子分型的方法。看家基因是有保守代谢功能的基因，进化相对缓慢，通过序列中碱基的变化可反映菌株之间的遗传关系和进化关系。在MLST结果分析中，每个单一的核普酸差异即可视为一个新的等位基因(allele)，把每个来自于同一看家基因的不同等位基因用阿拉伯数字编号，由此使得每个菌株中看家基因的等位基因都有相应的编号，最终可得到该菌株的由一串数字组成的等位基因号码，即该菌株的序列型(SequenceType,ST)。通过MLsT分型不仅可以判断菌株之间的亲缘关系，而且还可以推断它们是否有共同祖先,因此MLST技术被广泛地用于细菌病原菌的分类中。此外，多位点序列分型技术也可用于病原菌株遗传多样性和分子进化研究，构建系统发育树。由于该方法分辨率高，并克服了其他方法存在的不同实验室或实验室内部的结果可比性及重复性较差的缺陷，所以相关数据结果可通过网络实现数据共享和对比。

发明内容

为了克服现有技术的上述缺点与不足，本发明的目的在于建立一种基于全基因组测序的副猪嗜血杆菌的多位点序列分型技术体系，提供一种用于副猪嗜血杆菌分子分型的全基因组测序方法。

用于副猪嗜血杆菌分类鉴定和遗传多样性研究，所要解决的关键问题是副猪嗜血杆菌基因组DNA的提取、看家基因序列的确定、看家基因比对与分析、等位基因号与分型号的申请。为了解决上述技术问题，本发明提供了一种基于全基因组测序的副猪嗜血杆菌分子分型方法，该方法成功提取细菌基因组DNA，用DNAMAN软件对测序结果进行多序列比对，再于副猪嗜血杆菌MLST数据库中在线比对，确定7个看家基因序列，获得各个菌株序列型(ST)。

本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：