[发明专利]利用小泛素相关修饰物SUMO体外表达绵羊β-防御素的方法

说明书

一种利用小泛素相关修饰物SUMO体外表达绵羊β‑防御素的方法，利用SUMO融合技术通过RT‑PCR扩增蒙古绵羊β防御素sbd ‑1基因，与SUMO相连后,连入Pet‑22b中，获得pet‑22b‑SUMO‑sbd‑1重组质粒，转入到大肠杆菌BL21(DE3)细胞表达，成功构建pet‑22b‑SUMO‑sbd‑1重组载体，将表达产物通过超声破碎,脱盐,亲和层析,浓缩,SUMO酶切,冷冻干燥后,将其分别作用于大肠杆菌和金黄色葡萄球菌，通过抑菌实验证明，sbd‑1对大肠杆菌BL21能形成抑菌环，并且抑菌作用与浓度相关，最终得到了绵羊β‑防御素sbd‑1，为下一步代替抗生素提供理论基础,以及对大量生产β‑防御素(sbd‑1)提供方法依据｡

技术领域

本发明属于分子生物学领域，特别涉及一种利用小泛素相关修饰物SUMO体外表达绵羊β-防御素的方法及绵羊β-防御素。

背景技术

近几年来细菌的耐药性问题已日趋严重,使得对抗生素的要求也越来越高,然而抗生素的研究却无法赶上细菌耐药性的发展速度｡因此需要我们另辟蹊径｡在动植物机体内有一类庞大的内源性抗微生物多肽,简称抗菌肽｡抗菌肽是构成先天性免疫的重要组成物质,它有广谱高效杀菌(包括真菌)活性: 对G- ､G+､霉菌､厌氧菌､螺旋体､分支杆菌等均有较强的杀伤作用,同时对病毒,寄生虫,肿瘤等有明显的作用,特别是对癌细胞的抑杀作用｡对癌细胞和癌实体瘤有攻击作用而不破坏正常细胞｡同时有的抗菌肽还有促进伤口愈合,促生长,调节免疫, 提高抗体效价｡动物防御素是动物体内一种以含有β-折叠和6个半胱氨酸形成的3对二硫键框架的抗菌肽｡依其3对二硫键形成的方式的不同,防御素可分为,α-防御素､β-防御素和θ-防御素｡而β-防御素就是其中的一种｡β-防御素是一种含有6个半胱氨酸残基,前原肽由64个氨基酸构成的一种阳离子多肽｡主要存在于动物的上皮组织中｡防御素的成熟肽形式其分子量为3.5~6 kDa，富含精氨酸和阳离子｡它可以对革兰氏阳性菌､革兰氏阴性菌和病毒等产生抑制作用｡动物β-防御素是带正电荷的,具有两性的(亲水性和疏水性）结构。此结构使得动物β-防御素与生物膜相互作用的方式为，阳离子域接近生物膜的带负电的磷脂凸起，而与此同时动物β-防御素的疏水部分被隐藏于由疏水链脂肪酸组成的膜的内部,从而使细胞膜表面形成孔洞，细菌内外离子浓度相同，导致细菌死亡。

小泛素相关修饰物SUMO（mall ubiquitin-related modifier，SUMO）是由约100个氨基酸组成的保守多肽家族，为融合标签和分子伴侣可提高重组蛋白的可溶性和稳定性，利于重组蛋白的正确折叠。SUMO是一种与泛素化修饰类似的蛋白质翻译后的修饰方式，在调控蛋白质结构和功能方面发挥重要作用，蛋白质纯化奠定了良好的基础。

因此，利用SUMO融合技术构建表达载体pet-22b-SUMO-绵羊β-防御素sbd-1，以及在大肠杆菌中的表达条件，并将其进行优化得到具有生物活性的绵羊β-防御素sbd-1,为下一步代替抗生素提供理论基础,以及对大量生产β-防御素sbd-1提供方法依据。

发明内容

本发明的目的在于提供一种利用小泛素相关修饰物SUMO体外表达绵羊β-防御素的方法，它利用SUMO融合技术构建表达载体pet-22b-SUMO-绵羊β-防御素sbd-1,以及在大肠杆菌中的表达条件，并将其进行优化得到具有生物活性的绵羊β-防御素sbd-1,为下一步代替抗生素提供理论基础,以及对大量生产β-防御素sbd-1提供方法依据｡

本发明的目的是通过以下技术方案实现的：一种利用小泛素相关修饰物SUMO构建活性绵羊β-防御素sbd-1体外表达的方法，其特征在于：它包括以下步骤：

1）、以RT-PCR的方法获得克隆了sbd-1的成熟肽全基因序列；

2）、克隆入原核表达载体pet-22b中，构建表达载体pet-22b- SUMO-sbd-1；

3）、转化DH5α感受态细胞，提出SUMO-sbd-1蛋白；