[发明专利]利用HTRF高通量筛选LAG3/MHCII抑制剂的方法

说明书

本发明公开了一种利用HTRF高通量筛选LAG3/MHCII抑制剂的方法，属于抑制剂筛选方法领域。一种利用HTRF高通量筛选LAG3/MHCII抑制剂的方法，其特征在于包括如下步骤：步骤一，配置已构建好的带有不同标签的LAG3及MHCII蛋白，待筛选样品；步骤二，在微孔板中依次加入待筛选样品LAG3蛋白和MHCII蛋白，上述两种对应的抗标签抗体，分别偶联Donor和Acceptor；步骤三，室温孵育，用酶标仪读数检测读数，665nm/620nm的比值为原始数据。本发明应用在细胞株筛选方面，有效的节省了人力物力成本，缩短了时间，加快了生物制药行业的进程。

技术领域

本发明属于抑制剂筛选方法领域，具体涉及一种利用HTRF高通量筛选LAG3/MHCII抑制剂的方法。

背景技术

目前，在免疫检查点抑制剂药物研发领域，LAG3已经成为国内外药物研发的最热靶点之一。国内有多家外资和本土药企正在开发LAG3/MHCII的抑制剂。然而现阶段，国内外生物制药行业尚无生化水平直接筛选LAG3/MHCII抑制剂的均相方法，一是由于MHCII蛋白结构复杂(由多个不同亚型单体组合成的复合蛋白)，结合LAG3的结构域也不明确，二是由于均相方法的开发难度，需要实验多种标签蛋白及荧光能量的供体受体。在筛选蛋白相互作用的抑制剂时，经常通过FACS和ELISA的方法。FACS单个细胞过柱，通量很低。ELISA作为传统的方法，存在一些难以克服的缺点，如：1)实验步骤多，耗时长。需要经过多次洗板，加样，显色等，至少需要一天的时间；2)无法达到高通量，难以解决药物筛选样品多的难题；3)包被的蛋白有可能会屏蔽一些蛋白位点，致使漏掉阳性，即得到假阴性结果；4)由于步骤较多容易引起实验误差，导致结果重复性差，不稳定。

发明内容

为克服现有技术的不足，本发明提供了一种利用HTRF筛选LAG3/MHCII抑制剂的方法，通过本发明，实现了在短时间内高通量筛选，为快速高效的筛选LAG3/MHCII提供一种简洁有效的方法。

一种利用HTRF高通量筛选LAG3/MHCII抑制剂的方法，包括如下步骤：

步骤一，配置已构建好的带有不同标签的LAG3及MHCII蛋白，待筛选样品；

步骤二，在微孔板中依次加入待筛选样品LAG3蛋白和MHCII蛋白，上述两种对应的抗标签抗体，分别偶联Donor和Acceptor；

步骤三，室温孵育，用酶标仪读数检测读数，665nm/620nm的比值为原始数据；

其中上述偶联Donor和Acceptor的两种标签抗体分别检测相互作用的蛋白LAG3和MHCII，从而形成四个物质聚合的复合物，拉近Donor和Acceptor的距离，能量能够从Donor上转移到Acceptor上，使Acceptor产生荧光；若样品能抑制二者结合，则随着抑制剂浓度的增加，665nm/620nm的比值降低。待稳定后测定荧光值的变化便可量化抑制剂的效价IC50；检测的为HTRF两个荧光665nm和620nm，即时间分辨荧光，当665nm/620nm的比值越低，抑制剂的效应越高。

进一步，可用于筛选的抑制剂包括小分子化合物和各种来源的抗体。

进一步，上述LAG3和MHCII为重组蛋白，带有不同标签，其中MHCII为复杂的蛋白复合体，极难构建有结合活性的蛋白。

进一步，上述微孔板包括96孔板，384孔板和1536孔板。

进一步，该筛选方法的反应体系为20ul，最少可至8ul。

HTRF是均相时间分辨荧光技术的简称，技术是对TR-FRET技术的进一步改良。HTRF基于时间分辨荧光(TRF)其和荧光共振能量转移(FRET)两大技术。TRF利用稀土元素半衰期长的特性(毫秒级，较普通荧光纳秒级，有6个数量级差异)。所以可以通过延迟50-100微秒排除背景。