[发明专利]一种基于稳定同位素标记质谱联用技术检测血浆中羧酸类代谢物的方法

说明书

本发明涉及一种基于稳定同位素标记质谱联用技术检测血浆中羧酸类代谢物的方法，本方法通过对差异标记的血浆样品的信号识别，改善了质谱检测羧酸类代谢物时离子化效率低和灵敏度不足的问题，实现了样品中含羧基化合物的非靶向分析，还可用于稳定的相对定量。

技术领域

本发明涉及化学检验技术领域，具体涉及一种基于稳定同位素标记质谱联用技术检测血浆中羧酸类代谢物的方法。

背景技术

羧酸类代谢物构成了大量生物学上有意义的分子，包括小分子有机酸、脂肪酸、氨基酸、小分子肽等，已被证明以痕量水平参与了能量代谢、肠道菌代谢、胰岛素分泌和炎症反应等生理病理学过程，在调控各种生理功能中起着重要作用。因此，开发对羧酸类代谢物高灵敏度和高准确性的检测方法在生化研究和疾病诊断方面具有重要的意义。

目前对血浆中羧酸类代谢物的分离分析方法大多数是靶向的，即在有标准品的前提下对部分已知的感兴趣的羧酸类代谢物或某个代谢通路上的羧酸类代谢物进行准确定性定量分析。但获得全面性的代谢通路和总代谢物信息，在某种程度上被认为比单一代谢物实现非常低的检测限更重要。然而，目前针对血浆中羧酸类代谢物的全分析方法研究还较少。

质谱是一种高灵敏度和特异性的检测方法。羧酸类化合物通常在质谱负离子模式下检测，但检测灵敏度通常较低；由于羧基的低气相质子亲和力，羧酸类代谢物在正离子模式下常表现出较低的响应，同时用于分离羧酸的流动相(酸化以促进反相色谱的保留)不总与电喷雾电离-质谱相容；由于羧基间氢键的相互作用，羧酸类代谢物具有相对低的蒸气压，无法直接进入气相色谱-电子轰击-质谱中分析。此外，即使在相同的色谱条件下，质谱的信号响应容易波动，离子化效率易发生变化。因此，常在质谱分析前向样本中加入内标以矫正质谱信号的变化，但该方法仍有一些限制：代谢物可能不与内标共洗脱，引起定量的不准确；生物样本中的代谢物在结构和含量上的差异，使得内标的加入量难以确定；难以获取所有内标物等。因此，开发一种灵敏度高、定量准确且能对血浆中羧酸类代谢物进行全分析的方法显得尤为重要。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种基于稳定同位素标记质谱联用技术检测血浆中羧酸类代谢物的方法，本方法通过对差异标记的血浆样品的信号识别，改善了质谱检测羧酸类代谢物时离子化效率低和灵敏度不足的问题，实现了样品中含羧基化合物的非靶向分析，还可用于稳定的相对定量。

本发明的目的是通过如下技术方案实现的：

首先，本发明提供一种基于稳定同位素标记质谱联用技术检测血浆中羧酸类代谢物的方法，所述方法包含以下步骤：

(1)血浆样品溶液的制备：血浆中加入提取溶液进行提取，涡旋混匀后离心取上层有机相，于氮气下吹干，复溶于乙腈中作为样品溶液备用；

(2)样品溶液的同位素标记：取步骤(1)中的样品溶液与催化剂和激活剂充分混匀后，加入“轻”同位素衍生化试剂进行反应，反应完成后，反应体系置于-20℃条件下冷冻10min即终止反应，用缓慢氮气流吹干，所得固体样品复溶于乙腈/水(50/50，v/v)中，即得到“轻”同位素标记的衍生化产物；将“轻”同位素衍生化试剂换为“重”同位素衍生化试剂重复上述操作，得到“重”同位素标记的衍生化产物；将“轻”“重”衍生化产物等比例混合均匀，即得待测液；

(3)羧酸类代谢物的非靶向代谢组学分析：取步骤(2)中的待测液进行液相色谱-双中性丢失扫描-质谱检测，基于“轻”“重”衍生化产物的质荷比差异，扫描选定的中性丢失片段，结合保留时间与质谱信号强度进行筛选，找出潜在的羧酸类代谢物。

优选地，所述提取溶液包含提取剂和/或0.5％的甲酸；

优选地，所述提取剂选自乙酸乙酯、乙腈、甲苯、氯仿和正己烷中的一种或多种，优选为乙酸乙酯；

优选地，所述提取剂与0.5％的甲酸的体积比为30：1；