[发明专利]三元穿梭载体及利用其构建CYVCV侵染性克隆的方法在审
| 申请号： | 201810368251.3 | 申请日： | 2018-04-23 |
| 公开（公告）号： | CN108588113A | 公开（公告）日： | 2018-09-28 |
| 发明（设计）人： | 宋震;崔甜甜;宾羽;晏建红;李中安;周常勇 | 申请（专利权）人： | 西南大学 |
| 主分类号： | C12N15/82 | 分类号： | C12N15/82;C12N15/70;C12N15/66 |
| 代理公司： | 重庆市前沿专利事务所(普通合伙) 50211 | 代理人： | 邹晓艳 |
| 地址： | 400715*** | 国省代码： | 重庆;50 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 侵染性克隆 穿梭载体 全长cDNA 同源重组 构建 酵母菌 限制性内切酶 大肠杆菌 病毒 线性化载体 醋酸锂法 酵母转化 质粒转化 伴随的 共转化 农杆菌 线性化 柑桔 黄化 酶切 制备 克隆 筛选 失败 | ||
1.一种三元穿梭载体pTY，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO:11所示。
2.一种构建柑桔黄化脉明病毒侵染性克隆的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)制备CYVCV全长cDNA；
(2)采用限制性内切酶Stu I、Sma I酶切如SEQ ID NO:11所示的三元穿梭载体pTY，得到pTY线性化的载体；
(3)酵母转化伴随的同源重组：采用醋酸锂转化法将CYVCV全长cDNA的回收片段和线性化的三元穿梭载体pTY共转化酵母菌YPH501，在酵母细胞内完成线性化载体pTY与CYVCV全长cDNA的同源重组；
(4)侵染性克隆鉴定：提取同源重组后的酵母质粒，通过电击转入C58C1或GV3101等农杆菌感受态细胞中，筛选获得CYVCV侵染性克隆。
3.如权利要求2所述的构建CYVCV侵染性克隆的方法，其特征在于，步骤(1)中制备CYVCV全长cDNA的方法为长链RT-PCR，所用引物为分别如SEQ ID NO:3～4所示的pTY-CYVCVF和pTY-CYVCVR。
4.如权利要求2所述的构建CYVCV侵染性克隆的方法，其特征在于，步骤(2)中所述的三元穿梭载体pTY的构建方法为：
A、采用限制性内切酶Aor51H I单酶切双元载体质粒pXT1，得到线性化的载体；
B、以pYES1LVector为模板，以SEQ ID NO:1～2所示PYES2117F、PYES2117R为引物扩增，然后回收目的片段；
C、将线性化载体pXT1和步骤B得到的回收片段进行重组构建，转化大肠杆菌JM109，挑选阳性克隆，即得。
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