[发明专利]三元穿梭载体及利用其构建CYVCV侵染性克隆的方法

说明书

本发明公开了一种三元穿梭载体pTY，其序列如SEQ ID NO:11所示。还公开了一种利用pTY构建柑桔黄化脉明病毒(CYVCV)侵染性克隆的方法，包括如下步骤：(1)制备CYVCV全长cDNA；(2)采用限制性内切酶Stu I、Sma I酶切如SEQ ID NO:11所示三元穿梭载体pTY，得到pTY线性化的载体；(3)酵母转化伴随的同源重组：采用醋酸锂法将线性化载体pTY与CYVCV全长cDNA共转化酵母菌YPH501；(4)侵染性克隆鉴定：同源重组质粒转化农杆菌C58C1，筛选获得CYVCV侵染性克隆。本发明有效克服了病毒全长cDNA片段在大肠杆菌中产生毒性或不稳定导致克隆失败的现象。

技术领域

本发明属于分子生物学领域，涉及一种三元穿梭载体及利用其构建CYVCV侵染性克隆的方法。

背景技术

由柑桔黄化脉明病毒(CYVCV)引起的柑桔黄化脉明病，是一种新发现的柑桔病毒病害。该病最早是1988年在巴基斯坦的柠檬和酸橙上发现，其病毒会引起柠檬和酸橙出现嫩叶脉明、黄化、叶片反卷和皱缩等症状，严重时可导致嫩叶脱落、叶脉坏死，造成树势衰弱、果实产量下降、有时甚至绝收。1996年Grimaldi和Catara在出现黄化脉明症状的柠檬叶片上观察到一种纤维状病毒粒体，随后在印度的香橼、酸橙和柠檬等不同品种上也被观察到，并在巴基斯坦、土耳其迅速蔓延。中国于2009年在云南瑞丽柠檬上首次发现，之后在重庆、四川、江西等地也相继发现该病。CYVCV是α线性病毒科(Alphaflexiviridae)印度柑桔病毒属(Mandarivirus)的成员，病毒颗粒呈线状，直径为13～14nm，长约685nm。CYVCV为正义单链RNA病毒，CYVCV的基因结构具有一定的稳定性，不会因为来自不同地域不同寄主而产生较大变异，现发现的基因组有两种类型，一种为7529个核苷酸，一种为7531个核苷酸，包含5′和3′端非编码区(UTR)、6个开放阅读框(Openreading frame，ORFs)和Poly(A)尾巴。CYVCV的6个开放阅读框都起始于ATG，终止于TAA(ORF1、4、5)或TGA(ORF2、3、6)。

侵染性克隆不仅为病毒研究提供背景单一而可靠的遗传材料，还可用于研究病毒的移动、复制及其致病机理，同时还为深入研究病毒与寄主互作机制、进行病毒载体化改造和应用奠定坚实的基础。然而，病毒全长cDNA侵染性克隆的构建技术性较强，构建工作难度大，目前为止国内外尚无CYVCV侵染性克隆成功构建的报道。有研究表明，利用大肠杆菌构建较大基因组RNA病毒全长cDNA克隆时，由于其自身编码的病毒蛋白可能会对宿主菌产生毒性作用，从而导致非特异性重组，出现不稳定现象。这成为病毒侵染性克隆构建面临的最大困难和挑战。病毒全长基因组克隆在E.coli中存在的不稳定现象的机制仍不清楚。通常利用以下几个方法解决：将病毒序列分段克隆，侵染前再短暂的连接；或利用拷贝数目较低的载体；或是调控细菌生长的环境(如降低培养温度等)来减少毒性；也有利用插入内含子到病毒全基因组序列中来避免产生具有毒性的蛋白。但这些方法均耗时耗力且成功率低。