[发明专利]在体外大量扩增人类成熟高活性树突状细胞的方法及其应用

说明书

本发明提供了一种制备成熟高活性树突状细胞的方法，包括：1)从外周血或脐带血收集单个核细胞；2)诱导所述单个核细胞分化为树突状细胞；3)让所述树突状细胞与来自非致病性的非人类灵长类动物T淋巴细胞病毒蛋白接触；以及4)筛选和鉴定获得的成熟高活性树突状细胞。本发明还提供了通过该方法制备的成熟高活性树突状细胞及其使用方法。本发明所制备的树突状细胞增殖能力强、活性高且易于进行基因修饰改造，优于现有技术中所使用的树突状细胞。这些细胞和使用方法在肿瘤或病毒的免疫治疗方面有广阔的应用前景。

技术领域

本发明涉及制备树突状细胞的方法，尤其是在体外制备成熟高活性树突状细胞的方法。本发明还涉及由该方法制备的成熟高活性树突状细胞及其相关应用。

背景技术

免疫系统是人体识别和清除外来病原微生物(病毒)以及体内变异细胞(肿瘤)的最重要的系统。在免疫系统中发挥作用的功能单元是各类型的免疫细胞，包括巨噬细胞、B淋巴细胞、T淋巴细胞、自然杀伤细胞(NK)以及树突状细胞等。其中，B淋巴细胞通过产生抗体来抵抗外来抗原的入侵，主要参与体液免疫；T淋巴细胞、NK细胞等主要介导细胞免疫。树突状细胞作为抗原递呈细胞，在T细胞及NK细胞介导的细胞免疫方面起到非常关键的作用。

近两年，肿瘤免疫治疗成为全球关注的焦点。以PD1/PDL1抗体和CAR-T细胞为首的抗肿瘤免疫治疗药物取得突破性进展，先后被FDA批准上市。但是，不能忽视的是，无论是PD1/PDL1抗体还是CAR-T细胞技术，都还存在着一些缺陷亟待改善。首先是安全性问题。以PD1/PDL1抗体为例，因其缺乏良好的靶向性，用药后容易引起自身免疫性疾病，临床上已经证实该药物可引起严重的心肌炎并致死。同样，CAR-T 细胞引发的强烈的细胞因子风暴也会危及性命。其次是有效性问题。PD1/PDL1等抗体虽然在黑色素瘤、肾癌等多种癌症中都表现出较好的效果，但整体有效率在20％左右。CAR-T细胞目前只能治疗血液性肿瘤中的少部分B细胞淋巴瘤，而对实体瘤疗效不明显，适用范围非常窄。因此，通过免疫细胞抗击癌症的目标依旧任重而道远。

树突状细胞(dendritic cell，DC)作为人体天然免疫系统中最核心的成员，功能最强大的抗原递呈细胞，其潜在的应用价值受到极大的关注。DC细胞主要分为两个亚群，分别是骨髓来源的DC细胞(mDCs)和浆细胞型DC细胞(pDCs)。mDC细胞中的 CD11c+亚型相对丰富，而占少数的CD141+mDC细胞展现出一种强大的将MHC-I上的胞外抗原递呈到CD8T细胞上、并促进其分化成细胞毒性T细胞(CTL)的能力。在正常生理条件下，DC细胞处于未成熟及未活化状态，但在炎症因子、微生物等刺激下，pDC细胞通过分泌大量干扰素α(IFNα)介导抗炎反应；而mDC细胞通过将抗原呈递给幼稚T细胞，使其成熟活化为特异性杀伤的效应毒性T细胞，后者在抗肿瘤及抗病毒方面具有强大的作用。由此可知，树突状细胞通过活化特异性T细胞可以抵御肿瘤或病毒感染，理论上是一个非常好的临床应用对象。

但是，在癌症治疗方面，至今为止，仅有Sipuleucel-T这一个DC疫苗被FDA批准用于无症状或轻微症状的去势抵抗性前列腺癌。该疫苗是通将外周血单核细胞经 GM-CSF及IL4等细胞因子及肿瘤抗原肽刺激后产生的一种单核细胞衍生的树突状细胞(MoDC)，在临床治疗中表现出一定的疗效，但总的临床受益情况却相当有限。此种方法是目前临床上常用的方法，存在以下缺陷：第一，体外形成的MoDCs生长潜能有限并且很难培养较长时间，因此，多轮疫苗接种需要重复制备MoDC细胞才能完成，对患者身体损伤较大；第二，体外成熟活化的MoDCs并非真正意义上的CD141+DCs 细胞，其功能发挥上不能媲美原代DC细胞。而人体血液中，原代DC细胞仅占单个核细胞(mononuclear cell)数量的1％，难以达到治疗所需数量要求。