[发明专利]一种壳聚糖或壳聚糖盐中蛋白质含量的测定方法

说明书

本发明涉及一种壳聚糖或壳聚糖盐中蛋白质含量的测定方法，包括如下步骤：(1)配制库马斯亮蓝G‑250试液；(2)称取壳聚糖或壳聚糖盐样品，制得浓度为5mg/ml的样品溶液；(3)配制不同浓度的蛋白质标准溶液，加入库马斯亮蓝G‑250试液，绘制吸光度‑‑‑浓度曲线；(4)向样品溶液中加入库马斯亮蓝G‑250试液，测定样品溶液在595nm处的吸光度，计算样品中蛋白质含量。本发明通过在低于2％的盐酸浓度的条件下，采用超声处理15min并在100℃水浴处理待检测的壳聚糖/壳聚糖盐体系，然后通过特定浓度的库马斯亮蓝G‑250进行染色，经595nm处的吸光度值进行检测，可以显著提高蛋白质检测数值的准确度。

技术领域

本发明涉及一种壳聚糖或壳聚糖盐中蛋白质含量的测定方法，属于蛋白检测技术领域。

背景技术

库马斯亮蓝(Coomassie Bri1liant Blue)G-250是一种具有两种色调，在游离状态下呈红色，与蛋白质结合后转为青色，且其颜色深浅与蛋白质的浓度成正比的检测试剂。其颜色在595nm处有最大光吸处，可用分光光度计进行测定。由于其特殊的性质，使其在蛋白质检测领域被广泛的应用。

YY/T 0606.7-2008中详细记载了利用库马斯亮蓝(Coomassie Brilliant Blue)G-250检测壳聚糖中的蛋白质的方法。包括库马斯亮蓝G-250试液的配制：称取库马斯亮蓝G-250 100mg溶解于50mL的95％乙醇中，再加入85％的磷酸100mL，并用蒸馏水稀释至1000mL，置于棕色瓶内，室温贮存。蛋白质标准液(30μg/mL)的配制：精确吸取5％牛血清白蛋白标准液0.6mL于1000mL容量瓶中，用蒸馏水稀释至刻度,4℃下贮存。样品准备：精确称取105℃±2℃干燥至恒重的壳聚糖/壳聚糖盐约0.005g，置于样品管中，加1mL1％醋酸溶液/蒸馏水后，充分振荡混匀，使其完全溶解。测定步骤：制备蛋白质标准液系列，在标准液系列的各试管及样品试管中分别加入5mL的库马斯亮蓝G-250溶液。用漩涡式混合器使试管中溶液充分混合,并在室温20℃士10℃下放置15min。用不含蛋白质的样品作对照，用分光光度计测定595nm处各标准管和样品管的吸光度。用标准管绘制吸光度---浓度曲线，根据样品的吸光度按标准曲线计算样品管的蛋白质浓度。然后按下式计算蛋白质含量ρ₃(％):

式中：

ρ₁——样品管中壳聚糖或壳聚糖盐浓度,单位为微克每毫升(ug/mL)

ρ₂——样品管中蛋白质浓度,单位为微克每毫升(ug/mL)

但在实际检测过程中，发明人发现上述检测方法与实际蛋白质含量之间有一定差异，从而无法满足在壳聚糖或壳聚糖盐中对蛋白质的高精度检测。

虽然后续有科研人员对上述方法做了改进(韩婷、史国华等，《壳聚糖中蛋白质含量测定方法的研究》在《中国医疗器械杂志》2016年40卷第2期)，采用盐酸替换磷酸实现了防止壳聚糖沉淀的问题，提高了蛋白质含量测定的准确度，但依然无法满足高精度蛋白质含量检测的需求。

发明内容

本发明针对现有技术的不足，提供一种壳聚糖或壳聚糖盐中蛋白质含量的测定方法。

本发明技术方案如下：

一种壳聚糖或壳聚糖盐中蛋白质含量的测定方法，包括如下步骤：

(1)将库马斯亮蓝溶解于体积百分比浓度为95％的乙醇溶液中，加入浓盐酸，库马斯亮蓝G-250与浓盐酸的质量体积比为2:1，单位为mg/ml，蒸馏水稀释至库马斯亮蓝浓度为100mg/L，制得库马斯亮蓝G-250试液；