[发明专利]一种短链脱氢酶及其突变体与基因的制备及应用

说明书

本发明属于生物技术领域，涉及一种野生型短链脱氢酶LfSDR1与其突变体酶的基因、含有上述基因的重组表达载体的构建、重组表达转化体的制备，重组酶及重组酶的制备方法。通过将野生型短链脱氢酶LfSDR1突变获得具有两种立体选择性(R或者S立体选择性)的突变体酶，并利用突变体酶用于前手性酮的催化不对称还原，例如催化1‑苯基乙酮类化合物的不对称还原。本发明中的突变体相对于野生型，立体选择性得到了提高或者逆转，催化上述底物可以获取两种构型(R或者S型)的手性醇，例如光学纯的(R)‑或者(S)‑2‑氯‑1‑苯基乙醇，在手性醇制备领域具有很好的应用价值。

技术领域

本发明涉及生物工程技术领域，具体涉及短链脱氢酶LfSDH1突变体及其编码基因，含有所述短链脱氢酶突变体基因的重组表达载体与转化体构建，重组酶的制备方法，以及以不同突变体为催化剂催化不对称还原苯乙酮类化合物获取具有不同构型(S和R构型)的相应的光学纯手性苯乙醇类产物中的应用。

背景技术

光学纯的1-苯基乙醇类化合物，尤其是α卤素取代的1-苯基乙醇类化合物是药物及其他精细化学品合成过程中的重要手性中间体。目前多种获取光学纯的手性纯的方法被开发出来，包括动力学拆分与不对称合成两大类。利用前手性羰基化合物不对称合成方法的理论收率可达100％，是获取光学纯的1-苯基乙醇类化合物的重要途径。科研人员已经通过手性金属配体作为催化剂，开发出合成光学纯的手性醇的化学合成方法，并部分应用于工业生产，然而，由于其条件苛刻且存在重金属残留问题，在药物等合成中的应用受到了限制。生物催化以其环境友好、反应条件温和、区域及立体选择性高等优势，在手性醇的合成中受到了越来越多的关注。

自然界中存在的酮还原酶或醇脱氢酶大多是以符合Prelog规则的立体选择性来催化不对称还原产生一种构型的手性醇，然而在药物及化工合成中，两种构型的醇均是重要的合成中间体，因而限制了酮还原酶或醇脱氢酶在工业中的应用。例如符合Prelog规则的R-2-氯-1-(4-氟苯基)乙醇是合成胆固醇吸收抑制剂的手性中间体；符合反Prelog规则的R-1-(3,5-双三氟甲基苯基)乙醇是合成抗肿瘤辅助用药阿瑞匹坦的手性中间体。

为改善酮还原酶或醇脱氢酶在不对称催化合成光学纯的1-苯基乙醇类化合物过程中的实用性，通过蛋白质理性设计及定向进化方法改变酶催化性质的方法被越来越多的研究人员用来改造酮还原酶或醇脱氢酶的立体选择性。于洪伟等通过同源酶的结构指导，将来源于恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida ATCC 12633)的短链脱氢酶(PpYSDR)立体选择性改造为符合反Prelog规则，针对底物2,2,2-三氟-1-苯基乙酮突变体PpYSDR-M85T/W182V立体选择性由野生型的56.8(R)改变为99.5(S)(Chem.Commun.,2016,52,6284)；游松等通过蛋白质结构及计算机模拟辅助的方法将来源于光滑假丝酵母(Candida glabrataCGMCC2.234)的酮还原酶(CgKR1)改造为符合反Prelog规则的催化性质，针对底物2-氯-1-苯基乙酮突变体CgKR1-F92A立体选择性由野生型的23.1(R)改变为99.1(S)(ACSCatalysis,2016,6(9):6135-6140.)。

本实验室通过基因挖掘获取的来源于发酵乳酸杆菌的短链脱氢酶LfSDR1，野生状态下对苯乙酮表现出较差的立体选择性，例如催化还原底物2-氯-1-苯基乙酮得到相应醇的对映体过量值(ee)仅64.4(S)。通过理性设计及蛋白质定向进化提高及逆转该酶的立体选择性，实现不同构型的光学纯的手性醇的生物催化制备，具有十分重要的应用价值。

发明内容：

本发明目的在于解决现有发酵乳酸杆菌短链脱氢酶(LfSDR1)立体选择性低及立体选择性单一的问题，通过定点突变，获取该酶突变体、编码突变体的核酸、含有该核酸的重组表达载体及重组表达转化体，重组突变体酶催化1-苯基乙酮类不对称还原，制备相应相反构型(R和S构型)光学纯的手性醇中的应用。

为解决上述问题，本发明首先采取定点突变的技术，获取立体选择性改变的短链脱氢酶LfSDR1的突变体蛋白。