[发明专利]一种检测伪狂犬病毒的Taqman实时荧光PCR试剂盒及其检测方法

说明书

本发明公开了一种用于检测伪狂犬病毒的Taqman实时荧光PCR试剂盒及其检测方法，包括PCR反应缓冲液A、PRV引物探针混合液B、酶系C、阴性对照、阳性对照，检测方法如下：样本采集与处理；样本RNA的提取；在样本处理室内对样本RNA进行提取；PCR反应体系的配制；加样；扩增；(6)阴性结果判定：在FAM通道扩增曲线均不成S型且Ct值为UNDET；阳性结果判定：样本在FAM通道扩增曲线呈S型且Ct值≤36，则结果为阳性；实验灰度区：如果样本在FAM通道扩增曲线呈S型且36＜Ct＜38，则结果位于实验灰度区，应对样本进行复检；复检结果若扩增曲线呈S型，则判定结果为阳性，若扩增曲线不呈S型，则判定结果为阴性。本发明具有灵敏度高、使用效果好等优点。

技术领域

本发明涉及分子诊断技术领域，具体来说是一种检测伪狂犬病毒的Taqman实时荧光PCR试剂盒及其检测方法。

背景技术

伪狂犬病病毒(Pseudorabies virus,PRV)也称为奥耶斯基病病毒(Aujieszky’sdisease virus，ADV)，属于疱疹病毒科(Herpesuiridae)α-疱疹病毒亚科(Alpheresvae)。完整的病毒粒子呈圆形，直径150-180nm，核衣壳呈二十面体对称，直径为105-110nm，有囊膜和纤突。PRV基因组全长140-150kb，其GC含量高达73％，为高分子质量的连体环状体线状双链DNA。研究分析发现，PRV全基因编码约100种病毒蛋白，其中gC、gE、gG、gI、gM、是病毒复制非必需的糖蛋白。gE基因是PRV重要的毒立基因，促进感染细胞与邻近非感染细胞间融合介导细胞间扩散。

猪伪狂犬病(Porcine pseudorabies，PR)是由伪狂犬病病毒(Pseudorabiesvirus,PRV)侵染多种家畜和野生动物的急性传染病，被世界动物卫生组织(WorldOrganization for Animal Health，OIE)列为法定报告疾病，引起的一种以感染猪发热、脑脊髓炎为特征的传染病。猪是PRV的宿主，隐性感染猪可长期带毒并排毒，是该并的主要传染源，是造成PRV在猪场中难以根除并长期流行的主要原因。PRV感染怀孕母猪引起流产、死胎，初生仔猪感染病死率高，成年猪多呈隐性感染，是PRV传播的危险传染源。PRV在我国猪群中流行范围很广，造成巨大的经济损失，20世纪70年代以来，伪狂犬弱毒疫苗和基因缺失苗的广泛使用，一度使我国伪狂犬病得到了有效控制。目前该病仍在全国流行并出现了变异强毒株，有呈现卷土重来的势头，给养猪业造成沉重打击。

PRV在各种年龄的猪都易感染，但随猪年龄的不同其临床症状和病死率有很大的差异，较大猪发病过程较长，康复率也高。哺乳仔猪最为敏感，发病后呈急性型致死过程，15日龄以内仔猪表现为最急性型，病程不超过72h，病死率可达到100％临床上表现为上呼吸道内含有大量泡沫样的水肿液，喉黏膜和浆膜可见点状或斑状出血。淋巴结特别是肠淋巴结和下额淋巴结充血、肿大。脑为非化脓性脑膜炎，脑膜充血、水肿，脑实质有点状出血，病程较长者，脑脊液明显增多，心包液，胸、腹腔液增多，肝表面有大量钎维素渗出。此外，淋巴结、扁桃体、肾、脾和肝等一些器官有灰白色或黄白色病死灶。心机松软、心内膜有斑状出血，肾点状出血性炎症，肾上腺切面散状坏死点。

目前，PRV的检测方法主要有病毒分离鉴定、ELISA血清学试验和免疫荧光技术等。这些技术在PRV的检测中发挥了一定的作用，但也有不足之处，且工作量大、耗时长、成本高。由于，近年来，目前该病仍在全国流行并出现了变异强毒株，猪瘟在我国出现了新的流行特点，区域性大流行少见，而零散式发生的情况多见；典型猪瘟病例少见，而非典型猪瘟常见；持续感染和隐性感染的问题较为严重，本发明采用Taqman实时荧光PCR试剂盒及检测方法，特异性灵敏度高、检测时间短、检测成本低、具有快速检测病原、操作技术要求低和不易污染等优点，对诊断伪狂犬病毒早期感染和净化病毒有重要意义。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是为了克服现有技术中的效率低下、灵敏度不高的缺陷，而提供一种检测伪狂犬病毒的Taqman实时荧光PCR试剂盒及其检测方法。