[发明专利]用于检测绒螯蟹肝胞虫的实时荧光定量PCR引物对、检测试剂盒及应用

权利要求书

1.一种用于检测绒螯蟹肝胞虫的实时荧光定量PCR引物对，其特征在于，所述引物对由HE-F和HE-R组成，所述引物对的序列如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示。

2.一种用于检测绒螯蟹肝胞虫的实时荧光定量PCR检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒含有权利要求1所述的引物对。

3.根据权利要求2所述的用于检测绒螯蟹肝胞虫的实时荧光定量PCR检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括：Real-time PCR Mix、阳性标准品和阴性对照物。

4.根据权利要求3所述的用于检测绒螯蟹肝胞虫的实时荧光定量PCR检测试剂盒，其特征在于，所述阳性标准品是含有绒螯蟹肝胞虫基因片段的重组质粒，所述阴性对照物是双蒸水。

5.根据权利要求4所述的用于检测绒螯蟹肝胞虫的实时荧光定量PCR检测试剂盒，其特征在于，该基因片段长度为162bp，该基因片段的序列如SEQ ID NO:3所示。

6.根据权利要求4所述的用于检测绒螯蟹肝胞虫的实时荧光定量PCR检测试剂盒，其特征在于，所述阳性标准品的制备方法为：

（1）以绒螯蟹肝胞虫基因组DNA为PCR模板，以引物HE-F和HE-R为PCR引物，将PCR扩增后得到的DNA片段与PMD-18T载体进行连接得到重组质粒；

（2）将连接成功的阳性重组质粒测定浓度，10倍倍比稀释，取连续5个或5个以上不同梯度浓度的重组质粒在优化的反应条件下进行荧光定量PCR扩增，在5个或5个以上不同梯度浓度重组质粒满足扩增效率在90%-105%之间，组内和组间重复性试验的变异系数均小于2%的条件情况下，将这5个或5个以上不同梯度浓度的重组质粒作为阳性标准品。

7.权利要求2~5任一项所述的实时荧光定量PCR检测试剂盒在绒螯蟹肝胞虫检测方面的应用。

8.一种用于检测绒螯蟹肝胞虫的检测方法，其特征在于，所述检测方法是实时荧光定量PCR方法，所述检测方法步骤为：

（1）从待测样品中提取绒螯蟹肝胞虫基因组DNA；

（2）分别将绒螯蟹肝胞虫基因组DNA和阳性标准品作为模板，在包含权利要求1所述的引物对和荧光染料Real-time PCR Mix的优化反应条件中同时进行实时荧光定量PCR扩增，每个DNA浓度重复3次，以双蒸水作阴性对照；

（3）PCR扩增过程中，荧光定量PCR仪根据阳性标准品扩增产物的荧光信号到达设定域值所经历的循环数生成相应的Ct值，重复多次生成的Ct值取平均值得到△Ct值，以阳性标准品拷贝数的对数值为横坐标，△Ct值为纵坐标建立标准曲线，根据待检品的△Ct值在标准曲线上的位置确定待绒螯蟹肝胞虫的DNA初始浓度。

9.根据权利要求8所述的用于检测绒螯蟹肝胞虫的检测方法，其特征在于，所述优化的反应条件是，反应体系为20μL：Real-time PCR Mix 10.0μL；上游引物0.8μL；下游引物0.8μL；DNA模板2.0μL；ddH₂O6.4μL；反应程序为：95℃预变性3min；95℃变性12s；53℃退火20s，75.5℃收集荧光5s，40个循环；溶解曲线温度、时间设置为65℃ 5s，95℃ 5min。

10.根据权利要求8所述的用于检测绒螯蟹肝胞虫的检测方法，其特征在于，所述的实时荧光定量PCR扩增结果的判定标准为：待检品△Ct值为0，阴性对照无△Ct值，表示样品中不含绒螯蟹肝胞虫；待检品△Ct值小于或等于35，阴性对照无△Ct值，表示样品中含有绒螯蟹肝胞虫；待检品△Ct值大于35且小于40，阴性对照无△Ct值，则对该待检品重复检测，重复检测结果无△Ct值则该样品中不含绒螯蟹肝胞虫，重复检测如果得到相同的实验结果则该样品中含有绒螯蟹肝胞虫。