[发明专利]用于检测绒螯蟹肝胞虫的实时荧光定量PCR引物对、检测试剂盒及应用

说明书

本发明公开了用于检测绒螯蟹肝孢虫的实时荧光定量PCR引物对，所述引物对序列如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示。本发明还公开了实时荧光定量PCR检测试剂盒及其应用。本发明提供的引物对、试剂盒及检测方法在检测绒螯蟹肝孢虫上具有以下优点：与其他病原微孢子虫无交叉反应，特异性强；组内和组间重复性试验结果的变异系数均小于2%，重复性好；扩增效率为98.3%，最低可检测 2.87×10¹拷贝/μL，是普通PCR的100倍，本发明建立的方法扩增效率和检测的灵敏度更高；从绒螯蟹肝孢虫待检品提取DNA到结果分析整个实验过程只需要2h，检测效率大大提高。

技术领域

本发明涉及微生物分子检测领域，具体涉及一种检测绒螯蟹肝胞虫的实时荧光PCR引物对、检测试剂盒及应用。

背景技术

中华绒螯蟹(Eriocheir sinensis)，又称河蟹、大闸蟹,因其味道鲜美和营养丰富，深受广大消费者的喜爱，是我国主要养殖的经济蟹类。然而，随着集约化养殖的发展，河蟹各类疾病频发，其中“水瘪子”是近几年对河蟹造成危害最严重的病害之一，其引起的症状主要表现为病蟹的肝胰腺颜色发生变化，从健康时的黄色肝胰腺变浅到进一步发展至乳白和灰黑色，胸腔积液，肝胰腺和肌肉大量萎缩甚至消失等症状，给河蟹养殖业带来了巨大的经济损失。但是迄今导致河蟹“水瘪子”的原因众说纷纭，病毒、微孢子虫、细菌等生物因素及杀虫药物的滥用、养殖水质、种质退化和营养等非生物因子都被认为是可能的原因。

绒螯蟹肝胞虫(Hepatospora eriocheir)是一种寄生于中华绒螯蟹肝胰腺的微孢子虫。绒螯蟹肝胞虫的感染可能与“水瘪子”的发生相关。“水瘪子”是近几年对河蟹造成危害最严重的病害之一，给河蟹养殖业带来了巨大的经济损失。但是迄今导致河蟹“水瘪子”的原因众说纷纭，病毒、微孢子虫、细菌等生物因素及杀虫药物的滥用、养殖水质、种质退化和营养等非生物因子都被认为是可能的原因。之前有研究表明，绒螯蟹肝胞虫的感染可能与“水瘪子”的发生相关。

目前关于绒螯蟹肝胞虫的检测方法，主要有镜检法、常规PCR法、实时荧光定量PCR法以及原位杂交法。虽然这些方法都能达到检测绒螯蟹肝胞虫的目的，但是仍有一些不足，比如，漏诊率高，易出现假阳性，敏感性相对较低，操作繁琐，耗时长等，例如丁正峰建立的绒螯蟹肝胞虫实时荧光定量PCR检测方法，扩增效率只有79.1％，灵敏度检测下限只能达到200拷贝/μL，不适用于低浓度样本的绒螯蟹肝胞虫检测。

因此，现在需要建立一种高灵敏度、快速检测绒螯蟹肝胞虫的方法，该方法不仅可以为绒螯蟹肝孢虫的高灵敏度、快速准确检测提供有效技术手段，而且还可以为“水瘪子”病病因的初步筛查和“水瘪子”病的有效防控提供重要的技术支持和参考资料。

发明内容

发明目的：为建立一种高灵敏度、快速检测绒螯蟹肝胞虫的方法，本发明通过在分析和比对绒螯蟹肝胞虫18SrDNA基因序列的基础上，设计特异性引物扩增并克隆相应片段，构建由绒螯蟹肝胞虫基因片段和pMD-18载体连接而成的质粒标准品，建立了绒螯蟹肝孢虫的实时荧光定量PCR方法，该方法为绒螯蟹肝孢虫的高灵敏度、快速检测提供了一种有效的技术手段。

因此，本发明所要解决的技术问题是提供了用于高灵敏度、快速检测绒螯蟹肝胞虫的实时荧光定量PCR引物对。

本发明还要解决的技术问题是提供了一种用于检测绒螯蟹肝胞虫的试剂盒。

本发明还要解决的技术问题是提供了实时荧光定量PCR检测试剂盒在绒螯蟹肝胞虫检测方面的应用。

本发明还要解决的技术问题是提供了一种绒螯蟹肝胞虫的检测方法。

技术方案：为了解决现有技术存在的问题，本发明采用以下技术方案：一种用于检测绒螯蟹肝胞虫的引物对，所述引物对由HE-F和HE-R组成，所述引物对的序列如SEQID NO：1和SEQ ID NO：2所示。