[发明专利]一种以大白菜腋芽为外植体的快速繁育方法

说明书

本发明提供了一种以大白菜腋芽为外植体的快速繁育方法，具体包括以下步骤：切下腋芽作为外植体；对腋芽进行灭菌，清洗；将腋芽置于芽增殖培养基上进行培养；将外植体上增殖的芽切下，蘸取IBA溶液，在非琼脂固体培养基中进行不定根诱导；将再生苗转入花盆基质中置于室温下，给予自然光照培养。本发明以大白菜腋芽为外植体，对增殖培养基中植物生长调节物质的使用浓度进行了优化。利用已有的芽原基进行个体增殖，提高了大白菜组织培养的再生效率，成芽速度快，且受基因型影响较小。培养过程简单，可以在短时间内对优异的育种材料和种质资源及时扩繁与利用，大大加速育种进程，为解决AA基因组作物的再生难题提供了新的途径。

技术领域

本发明涉及植物组织培养技术领域，具体涉及一种以大白菜腋芽为外植体的快速繁育方法。

背景技术

起源于中国的大白菜(Brassica rapa L.)由于种植面积广和消费量巨大，一直以来是亚洲最重要的蔬菜之一。随着生活水平和蔬菜生产水平的提高，消费者对于大白菜品种多样化的需求越来越迫切(张凤兰等，2017)。提高育种效率是加快育成大白菜新品种的关键。组织培养作为一种重要的生物技术工具，对于快速繁殖大白菜育种过程中的各种材料(优良变异株、自交系、杂交组合和地方品种等)具有不可替代的作用。迄今为止，国内外研究者通过采用不同外植体及不同培养基组成建立了多种类型的大白菜再生体系。从带子叶的子叶柄(Zhang等，1998；Zhao等，2013；Ma等，2017)、下胚轴(Zhu等，2005；Jung等，2012；Baskar等，2016)和真叶等(Liu等，2018)均可以较高频率再生不定芽(Zhang等，1998)。此外，采用小孢子(Han等，2014；Huang等，2016)，花药(Yasuhisa等，1997；Choi等，1998)和原生质体(Glimelius等，1984)诱导体细胞胚的方式也可以获得再生植株。然而，由于操作过程复杂，对技术要求较高，以上诱导胚的方法在快速扩繁植株方面应用较少。

上述研究中用于不定芽再生的外植体均需要经过较长时间的脱分化和再分化过程才能诱导形成不定芽。并且基因型对再生频率的影响是上述各种再生方法中都存在的问题。芽组织是植物细胞分裂较活跃的部位，木本植物的芽在休眠之后会抽生新的枝叶或形成花。作为食用器官的大白菜叶球也是一种变态的顶芽(柯桂兰，2009)，因大白菜具有特殊的短缩营养茎的结构，其顶芽生长锥上分化的叶原基和芽原基往往被忽视而得不到有效利用。经过申请人对10个大白菜品种的调查发现，收获期的大白菜(包括娃娃菜)单个叶球基部通常有25-45个长度≥2mm的腋芽。如能对数量众多的腋芽进行培养，就可以省略组织培养的脱分化过程，直接利用已有的芽原基获得新的植株，并且这些外植体具有完全相同的遗传组成。这对于珍贵育种材料的大量保存和繁殖具有重要意义。而根据现有报道，目前没有涉及成熟大白菜腋芽的大白菜植株快繁研究。

发明内容

本发明的目的是提供了一种取材便利、成本低、不需要经过脱分化的一种以大白菜腋芽为外植体的快速扩繁方法。本发明省去以往大白菜组织培养过程中通过外植体脱分化-再分化过程形成不定芽的环节。通过直接培养已经形成的腋芽组织，使已经分化的叶原基和芽原基快速生长发育从而获得幼芽。该方法可以在短时间内使优良珍贵的育种材料得到及时保存和扩繁，从生物技术方面为提高大白菜育种效率提供新的技术途径。

为实现上述发明目的，本发明采用以下技术方案予以实现：

本发明提供了一种以大白菜腋芽为外植体的快速繁育方法，包括以下步骤：

1)选取结球期大白菜，剥去叶球外叶，将叶柄基部与短缩茎连接处的腋芽切下；

2)在无菌条件下，先用酒精进行表面消毒，无菌水漂洗；再倒入NaClO溶液灭菌，无菌水漂洗；漂洗结束后，吸干腋芽的多余水分；灭菌后，将腋芽基部多余的短缩茎组织切除；

3)将腋芽的芽尖向上置于芽增殖培养基上进行培养；