[发明专利]一种标记β-D葡聚糖的结合蛋白及其纯化合成方法

说明书

本发明公开了一种标记β‑D葡聚糖的结合蛋白及其纯化合成方法，其中包括载体系统的转化及对表达菌株的优化诱导，少量试验后对高表达菌株筛选培养，进行大量的蛋白纯化合成洗脱。本发明产品通过构建好的表达载体转化到表达菌株内，筛选菌落并进行PCR测序验证，得到阳性菌株，进行少量预实验后，同时进行SDS‑PAGE,确认目的蛋白的表达，筛选出高表达菌株，随后对该高表达菌株进行大量培养，再进一步进行大量蛋白纯化，该结合蛋白能够有效与真菌细胞壁成份β‑D葡聚糖进行免疫亲和，准确标记真菌表面β‑D葡聚糖抗原。

技术领域

本发明属于生物医学诊断技术领域，具体涉及一种能够标记真菌细胞壁成份β-D葡聚糖的结合蛋白及其纯化合成方法。

背景技术

真菌广泛分布于自然界，绝大多数对人类无害甚至有益，但其中400余种可引起人类疾病，亦即为我们所称致病性真菌。致病真菌可分为皮肤癣菌、酵母菌和霉菌。真菌引起的疾病称为真菌病，临床上真菌病可分为浅部真菌病和深部真菌病或系统性真菌病。浅部真菌病由只侵犯人体皮肤、毛发和甲等浅表组织的真菌引起。在我国90%以上的真菌病属于浅部真菌病。引起系统性真菌病的病原真菌包括组织胞浆菌、芽生菌、球孢子菌和副球孢子菌，这些都是双相真菌，在自然界中以霉菌形态菌如隐球菌属、念珠菌属、曲霉属等均可致严重的系统感染。

随着器官移植的大量开展及免疫抑制剂、肿瘤患者化疗药物的广泛使用，糖皮质类固醇激素的长期使用，体腔内有创检查的大量开展，人口老龄化和糖尿病等慢性疾病患者的增多，真菌病的发病率和死亡率在逐年增加，对人类健康的危害日趋严重。然而，作为条件致病真菌及大自然中原本认为不致病的真菌种类，近年发现在逐年上升，由于对很多真菌感染的微生物学特性了解甚少，因而出现临床诊治的困难，加之真菌感染的临床表现多种多样，故通常会出现临床的误诊漏诊，导致患者病情迁延甚至危及生命。面对这种现状，如何真菌病的诊断水平已成为国内外临床工作者们共同关心的热点问题，解决这一问题的关键在于提高实验室的真菌鉴定水平。尽管分子生物学等非培养技术的迅猛发展，目前仍缺乏早期快速的诊断方法，这些都给真菌病的预防和诊治带来挑战。因此，逐步开展临床致病真菌检测的研究对于临床上致病真菌的快速诊断及早期针对性的用药具有深刻的指导意义。

临床常见的用于真菌检测的方法包括镜检法、培养法和组织病理学方法等。

1.直接镜检法：直接涂片镜检是一种常用、简便而迅速的真菌检测方法,对真菌感染的诊断具有重要意义。直接涂片镜检是将所取标本直接置于玻片上,用染色或加10％KOH溶液,在光镜下检查。但是真菌与组织细胞之间的反差不大，鉴别真菌非常困难，还需要进一步培养鉴定。另外,直接镜检阴性也不能排除真菌感染的可能性。

2.分离培养方法：从临床标本中对致病菌进行培养，目的在于从临床标本中分离真菌,以确定是否有真菌感染,特别是在直接镜检为阴性时。从疑似患者身上采集的标本可以直接接种在培养基上。一般培养超过2周仍无真菌生长,可报告阴性。培养法虽然检测结果准确性高，但由于真菌生长缓慢,培养常需要数天甚至数周才有结果，常会延误患者病情。

3.组织病理学检查：真菌病的组织病理检查与直接镜检法和培养法同样具有相当重要的价值，尤其对于深部真菌病的诊断意义更大。通过病理组织的检查可确立感染的存在，排除真菌学检查中出现的污染等现象，PAS 染色、嗜银染色、黏蛋白卡红染色及阿尔辛蓝染色等可有助于组织中真菌的检测。然而，组织病理学染色只能确定部分真菌种属，适用范围受到限制。

β-D葡聚糖结合蛋白的抗体和荧光增白剂两种成分，其中β-D葡聚糖结合蛋白的抗体可特异性识别β-D葡聚糖成分，荧光增白剂共价结合几丁质多糖，双重标记真菌。荧光激发后在荧光显微镜的紫外激发光下呈现荧光。使用该结合蛋白抗体进行真菌检测，是区别于传统检验方法：直接镜检法和生化检测法两者的一种免疫荧光检测方法。其结合了免疫学及形态学的诊断方法，利用直接镜检的基本操作方法，通过抗体蛋白与真菌细胞壁β-D葡聚糖成分特异性结合，荧光增白剂共价结合几丁质多糖，双重标记真菌，能够对真菌感染导致的各种疾病，做出快速、准确的实验室检测。该方法具有阳性率高、适用范围广等优点。