[发明专利]环氧水解酶突变体及其在对映归一水解环氧化物中的应用

说明书

本发明涉及环氧水解酶突变体及其在对映归一水解环氧化物中的应用。本发明揭示了一类环氧水解酶突变体，所述突变体具有非常高的催化活性和立体选择性。本发明还揭示了所述环氧水解酶突变体的应用。利用本发明的环氧水解酶突变体催化消旋苯乙烯氧化物及其衍生物的对映归一水解反应，具有对映归一性程度高、反应条件温和、环境友好、产品光学纯度高等优势，所获得的突变位点在其他环氧水解酶中具有普适性，具有非常广阔的应用前景。

技术领域

本发明属于化学合成和酶工程领域，更具体地，本发明涉及环氧水解酶突变体及其在水解环氧化物中的应用。

背景技术

由环氧化物衍生得到的邻位二醇是许多药物合成的重要中间体和手性砌块，具有广泛的合成应用价值。例如以对硝基苯乙烯氧化物为出发底物合成的对硝基苯基乙二醇是合成β-blocker类药物Nifenalol和DCI的重要手性中间体，β-blocker类药物具有抗心律失常及心绞痛的作用，主要用于治疗心血管疾病，具有重要的应用价值。而这类药物的药效与产品的光学纯度密切相关，光学纯度越高，则其药效就越明显。

以苯乙烯氧化物及其衍生物为出发底物，采用化学或生物法水解是制备高光学纯度手性芳基邻位二醇的重要方法。化学方法中，通常在金属催化剂与相应手性配体配合作用下，催化环氧化物选择性水解生成相应的具有光学活性的邻位二醇，该方法反应条件较为苛刻而且需要重金属作为催化剂，容易造成环境污染，而且很难突破传统动力学拆分50％的得率限制。

环氧水解酶(Epoxide hydrolases，简称EHs，EC 3.3.2.3)能够在水分子的参与下催化环氧化物的水解生成对应的手性邻位二醇。作为绿色催化剂，环氧水解酶具有酶的来源广泛、立体选择性好、反应过程中不需要金属离子和辅酶等优点，已被广泛应用于外消旋环氧化物的对映选择性水解拆分，制备高光学纯度的环氧化物及邻位二醇。尽管如此，大部分环氧水解酶只能催化外消旋环氧化物的动力学水解拆分，最大理论得率仅为50％。

有少数一些环氧水解酶可以催化具有特定结构的环氧化物的对映归一性水解反应。这类酶对于相反对映体构型的底物具有互补的区域选择性，使得催化反应过程中一种构型的底物水解后立体构型得到保留，而另一种构型的底物水解后立体构型发生反转，最终外消旋底物的两种对映异构体都被水解，得到同一种构型的水解产物，这种独特的底物水解方式称为对映归一性水解。通过对映归一性水解可以实现底物的完全转化，轻易突破传统动力学拆分的50％的得率限制，显著提高产品的收率，降低成本。但是在已报道的环氧水解酶中，仅有很少几个酶具有这种催化特性。来源于植物的土豆环氧水解酶(StEH)以及绿豆环氧水解酶(VrEHs)可以催化苯乙烯氧化物及其衍生物对映归一性地水解生成高光学纯度的产物二醇。2004年，Furstoss课题组利用土豆的环氧水解酶对映归一性水解间氯苯乙烯氧化物，可实现底物的完全转化，产物(R)-间氯苯乙二醇的ee值为91％(Tetrahedron:Asymmetry,2004,15,2801-2805)。来源于绿豆的环氧水解酶VrEH2能够对映归一性水解对硝基苯乙烯氧化物获得(R)-对硝基苯乙二醇，产物最终的ee值为82.4％(OrganicLetters,2006,8,1737-1740)。目前为止，已报道的具有对映归一性环氧化物水解性能的环氧水解酶的立体选择性都不完美，水解产物邻位二醇的光学纯度不够理想，达不到医药手性砌块98％以上ee值的要求，并且酶的活性较差，催化剂用量大。

综上所述，目前已报道少数几种环氧水解酶可以催化部分环氧化物的对映归一性完全水解生成相应的光学活性邻位二醇，但已知的这些环氧水解酶存在着催化活性较低，立体选择性不高，水解产物的光学纯度不理想等问题。因此，需要开发催化反应效率高、选择性好的酶催化剂，以减少催化剂用量，满足低成本、过程操作简单、产物易分离的工业化需求。

发明内容

本发明的目的在于提供绿豆环氧水解酶突变体及其在水解环氧化物中的应用。

在本发明的第一方面，提供环氧水解酶突变体，所述突变体相对于野生型的环氧水解酶，其空间结构中底物结合口袋附近的氨基酸发生突变。