[发明专利]一种翘嘴鲌亲子鉴定微卫星荧光多重PCR的方法

权利要求书

1.一种翘嘴鲌亲子鉴定微卫星荧光多重PCR的方法，包括以下步骤：

（1)翘嘴鲌样本DNA提取

取翘嘴鲌个体的鳍条，采取酚—氯仿法提取基因组DNA，将获得的DNA测定浓度后稀释至约50ng/μl；

（2)翘嘴鲌多态性微卫星序列的筛选

用步骤(1)获得的基因组DNA为模板，根据Primer Premier 6.0软件设计微卫星位点引物，合成引物，并通过对翘嘴鲌个体进行PCR扩增，筛选出16对引物，所述引物包括正向引物、反向引物；

（3)对微卫星位点多重PCR扩增效果摸索、确定

进行多重PCR扩增：对步骤（2) 中筛选得到的16对引物按照扩增后的PCR产物按照120-180bp、200-260bp、280-340bp、360-420bp四个不同区间进行初步分组；首先两两组合，选出扩增清晰的组合，再依次进行3个和4个位点的多重PCR体系的构建；最终获得由12个微卫星位点组成的3组4重 PCR体系，将每个位点上游引物的5'端进行荧光修饰，然后，对所有亲本和子代DNA样本进行多重PCR扩增；所述的3组4重PCR体系的引物信息如下所示：

第一组引物信息：

Cal018位点的引物为：上游引物：ATGAACACAACTTACC（5'-3'）、下游引物CAAGGACAAGGATTATG（5'-3'）；

Cal029位点的引物为：上游引物：TACTGAGTGAGAAACCTTTCC（5'-3'）、下游引物：AACTACCAATGCCTGATTCC（5'-3'）；

Cal006位点的引物为：上游引物：GCGTATTCCTCTCCTGATTC（5'-3'）、下游引物AGATGTCGTGGTTAGTTTCA（5'-3'）；

Cal019位点的引物为：上游引物：GTATAACACAGAATGACACAGG（5'-3'）、下游引物：TTCACGCACTTCAAACACT（5'-3'）；

第二组引物信息：

Cal050位点的引物为：上游引物：AAGTAGAGCGAGCAGAGA（5'-3'）、下游引物GAGAGCATTCAGGAAGCA（5'-3'）；

Cal053位点的引物为：上游引物：CCATATCCAGCACTCTAACA（5'-3'）、下游引物TCATCAACTCTCACACTCTC（5'-3'）；

Cal049位点的引物为：上游引物：TGTGTCGTGATGGAGGAG（5'-3'）、下游引物GCGGTGTTCTGCTTCTTC（5'-3'）；

Cal054位点的引物为：上游引物：TGGCACAACAACACAGAC（5'-3'）、下游引物AGACCTCCTCCTCTTCTC（5'-3'）；

第三组引物信息：

Cal052位点的引物为：上游引物：ACCTGTCCACCTCAATCA（5'-3'）、下游引物GAATCTGCCGTTCTCACTA（5'-3'）；

Cal046位点的引物为：上游引物：TTGGACTGAGAGAAGGAAAT（5'-3'）、下游引物AAGAGACTGAACATTGAAGC（5'-3'）；

Cal017位点的引物为：上游引物：ACCGCAACATTACAAAGAC（5'-3'）、下游引物GCATAGTGACATCATAGCAT（5'-3'）；

Cal001位点的引物为：上游引物：CCTGCTATTGTTTCTTTCATCC（5'-3'）、下游引物TTCCATATCCTCTCATCCTTCA（5'-3'）；

4)获取翘嘴鲌样本的基因型数据。