[发明专利]一种翘嘴鲌亲子鉴定微卫星荧光多重PCR的方法

说明书

本发明涉及一种翘嘴鲌亲子鉴定微卫星荧光多重PCR的方法，首先筛选出16对SSR引物，通过优化组合选出12对组成3个多重PCR组；然后在一个PCR反应体系中加入同属一组但浓度不同的4对SSR特异性引物对，采用不同的反应体系同时对同一个DNA模板的不同区域扩增出多个目的片段；通过电泳抽样检测后送生物公司在测序仪上进行分型，并获取样本相应位点的基因型；最终用于分析亲本和子代的亲子关系。本发明涉及的微卫星标记的扩增体系，节约DNA样本，实验效率高，可在翘嘴鲌的亲子鉴定、种群遗传多样性和遗传结构的评估方面进行推广。

技术领域

本发明属于水产养殖领域中的水产动物种质鉴定技术，具体涉及一种翘嘴鲌亲子鉴定微卫星荧光多重PCR的方法，利用多重PCR对翘嘴鲌进行SSR分析的方法，适合在翘嘴鲌选育和养殖过程中进行种质鉴定和系谱管理。

背景技术

翘嘴鲌(Culter alburnus Basilewsky)是鲌亚科中体型最大的一种鱼类，隶属于鲤科(Cyprinida)、鲌亚科(Culterinae)、鲌属(Culter)，广泛分布于中国各大水系。太湖中出产的翘嘴鲌被誉为“太湖三白”之一，其肉白而细嫩，味美而不腥。此外，翘嘴鲌在淡水水域生态系统中处于食物链的顶端，对维持生态系统的稳定具有重要作用。

分子标记是种质资源鉴定、家系选育和放流效果评估等研究和应用中一个重要技术手段。在家系选育中，了解整个家系遗传多样性，子代与亲代的对应关系以及子代与子代的关系，可以指导亲本选留，从而避免近亲繁殖，对于预防种质衰退具有重要作用。

微卫星DNA是真核生物基因组中短的串联重复序列。由于微卫星位点数量多，在基因组中均匀分布，共显性遗传且易于检测，微卫星DNA得到了广泛的应用。翘嘴鲌的微卫星已用来解决遗传多样性、遗传结构等问题。但是，上述遗传学实验均需要采用多个微卫星位点，研究者需要花费大量的时间和实验成本。更重要的是，要消耗较多的DNA样本。故发明一种对样本量要求少、成本低、高效的微卫星实验体系对于翘嘴鲌的育种研究来说具有重要的意义。

目前，其它物种的微卫星遗传学研究中采用多重PCR以解决上述问题。微卫星多重PCR指在一个PCR体系中加入多对微卫星特异性引物，对同一个模板的不同区域进行同时扩增的PCR技术。微卫星多重PCR可以同时扩增多个目的片段，能够达到节约实验样品、实验成本、提高实验效率的目的。微卫星多重PCR的核心内容在于如何设计和优化引物组合，使得引物之间不存在相互作用、不产生非特异扩增、不使扩增产物重叠。尽管微卫星多重PCR技术已在其他物种中广泛得到应用，但是迄今为止，翘嘴鲌微卫星多重PCR体系仍末建立起来。

发明内容

本发明的目的在于提供一套高效的翘嘴鲌微卫星位点的四重PCR体系的检测方法，该方法选用有效的微卫星引物，可靠、高效，能对翘嘴鲌进行亲子鉴定，还能用于家系管理和增殖放流效果评估。

本发明的上述目的是通过如下技术方案来实现的：一种翘嘴鲌亲子鉴定微卫星荧光多重PCR的方法，首先筛选出16对SSR引物，通过优化组合选出12对组成3个多重PCR组；然后在一个PCR反应体系中加入同属一组但浓度不同的4对SSR特异性引物对，采用不同的反应体系同时对同一个DNA模板的不同区域扩增出多个目的片段；通过电泳抽样检测后送生物公司在测序仪上进行分型，并获取样本相应位点的基因型；最终用于分析亲本和子代的亲子关系。

具体地，本发明技术方案包括以下步骤：

（1) 翘嘴鲌样本DNA提取

取翘嘴鲌个体的鳍条，采取酚—氯仿法提取基因组DNA，将获得的DNA测定浓度后稀释至约50ng/μl。

（2) 翘嘴鲌多态性微卫星序列的筛选