[发明专利]体外活化记忆性B细胞成浆细胞的方法

权利要求书

1.体外活化记忆性B细胞成浆细胞的方法，其特征在于，包括以下步骤：用丝裂霉素C处理的NIH-3T3/mCD40L细胞作为饲养层细胞，10%-20% FBS的IMDM作为基础培养基，以CpG、IL-2和IL-21作为诱导剂，在体外诱导记忆性B细胞转化为浆细胞。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述基础培养基中FBS的含量为10%。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述用丝裂霉素C处理是指用浓度为10μg/mL的丝裂霉素C于37℃温度下处理1-2 h。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述用丝裂霉素C处理是指用浓度为10μg/mL的丝裂霉素C于37℃温度下处理2 h。

5.根据权利要求1、2、3或4所述的方法，其特征在于，所述IL-2的用量为使培养基中IL-2的浓度为8-16 ng/mL，IL-21用量为使培养基中IL-21的浓度为50-100 ng/mL，CpG的用量为使培养基中CpG浓度为2.5 μg/mL。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述IL-2的用量为使培养基中IL-2的浓度为8 ng/mL，IL-21用量为使培养基中IL-21的浓度为50 ng/mL，CpG的用量为使培养基中CpG的浓度为2.5 ng/mL。

7.根据权利要求1、2、3、4、5或6所述的方法，其特征在于，所述体外诱导具体是指于37℃、5%CO₂的空气中培养。

8.根据权利要求1、2、3、4、5、6或7所述的方法，其特征在于，包括以下步骤：

A.饲养细胞的准备：将饲养细胞NIH-3T3/mCD40L以10 μg/mL的丝裂霉素C于37℃温度下处理1-2 h，再用无菌PBS缓冲液清洗细胞，用0.05%-0.25%的胰酶溶液处理细胞，然后离心去除沉淀，再用10%-20% FBS的DMEM重悬细胞，接种培养；

B.脾淋巴细胞的制备：杀死免疫小鼠后消毒，然后分离脾脏放入器皿中，并用剪刀将脾脏剪碎，加入PBS缓冲液润湿脾脏，将组织块碾磨后过滤，收集细胞悬液；将细胞悬液离心后弃上清液，将沉淀加入红细胞裂解液，混匀后静置；然后将FBS加入细胞悬液中，离心后弃上清液，将沉淀以缓冲液重悬；

C.记忆性B细胞的分选：去除小鼠脾脏记忆性B细胞中的非记忆性B细胞，然后收集并标记记忆性B细胞；

D.记忆性B细胞的活化培养：配制活化培养基IMDM+10%FBS，并在其中加入IL-2， IL-21和CpG，使得培养基中IL-2的浓度为8-32 ng/mL，IL-21的浓度为50-100 ng/mL，CpG的浓度为2.5 μg/ml，然后将记忆B细胞于37℃、5%CO₂的空气中培养。