[发明专利]一株降解咖啡因的解淀粉芽胞杆菌工程菌及应用

说明书

本发明属于基因工程和微生物代谢工程技术领域，公开了一株高效降解咖啡因的解淀粉芽胞杆菌工程菌及应用，申请人将咖啡因降解的5个基因ndmA，ndmB，ndmC，ndmD和ndmE加上枯草芽胞杆菌168的启动子P43和淀粉酶终止子TamyL，通过同源重组整合解淀粉芽胞杆菌LX‑12的基因组噬菌体位点,筛选后，得到整合菌株解淀粉芽胞杆菌HZ‑12::ndmABCDE，成功实现咖啡因降解。该菌株在500mg/L咖啡因的基础培养基中，对咖啡因的降解率为52.6%，比原始菌株提高31.5%，为低咖啡因茶和咖啡的制作及其废弃物再利用奠定了基础。

技术领域

本发明属于基因工程和微生物代谢工程技术领域，涉及一株高效降解咖啡因的解淀粉芽胞杆菌工程菌及应用。

背景技术

咖啡因又称1,3,7-三甲基黄嘌呤，化学式为C₈H₁₀N₄O₂，属于嘌呤碱，广泛存在于茶，咖啡，巧克力，制药产品及多种饮料产品中。长期摄入咖啡因可导致头痛，肾上腺刺激，肌肉活动不规律，心律失常，骨质疏松，并对心脏病患者有不良影响。怀孕期间摄入咖啡因导致胎儿畸形，降低生育率。因而，开发脱咖啡因饮料和食品非常重要。除了对健康的担忧之外，咖啡因给环境的带来很大影响。茶和咖啡产业的固体废弃物如茶渣、咖啡渣、咖啡壳含有高浓度的咖啡因，咖啡因作为主要有毒物质之一，导致这些富含碳水化合物和蛋白质的固体废弃物无法作为饲料或肥料再利用，茶和咖啡加工厂的流出液由于含有高浓度咖啡因，因此不允许流入湖泊河流。

研究发现，多种真菌和细菌可降解咖啡因，真菌主要包括曲霉，青霉，根霉等，目前对真菌的研究较少；细菌主要包括假单胞菌株，不动杆菌，产碱杆菌属等，其中恶臭假单胞菌株是研究最多的咖啡因降解菌株。WoolfolkCA从1975年开始研究恶臭假单胞菌降解咖啡因途径。Summers等人于2012，2013年找出恶臭假单胞菌株中降解咖啡因至嘌呤的5个基因，分别为ndmA，ndmB，ndmC，ndmD和ndmE，NdmA和NdmB是两个独立的Rieske非血红素铁单氧酶分别具有N-1和N-3专一脱甲基活性。NdmA和NdmB均依赖从NADH转移电子给Rieske还原酶NdmD。NdmC为N-7专一脱甲基酶,与NdmD和NdmE组成一种新型的谷胱甘肽-S-转移酶(GST)复合蛋白,催化7-甲基黄嘌呤脱甲基生成黄嘌呤，黄嘌呤再由细胞进一步代谢。

恶臭假单胞菌株具有腥臭味，应用在生产低咖啡因茶和咖啡时，对茶和咖啡的风味造成影响，而在解淀粉芽胞杆菌整合表达可解决上述问题；且上述ndmABCDE在恶臭假单胞菌株中诱导表达，当培养基有多种碳氮源时，恶臭假单胞菌株对咖啡因的降解效率降低，不宜工业应用。

本发明提供的整合菌株解淀粉芽胞杆菌HZ-12::ndmABCDE其整合基因带有强启动子，组成表达咖啡因降解酶达到高效降解咖啡因目的。为生产低咖啡因茶和咖啡以及茶渣等废弃物的再利用奠定基础。

发明内容

本发明的目的在于提供了一株可高效降解咖啡因的解淀粉芽胞杆菌工程菌，所述解淀粉芽胞杆菌于2017年12月18日送至武汉大学中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M2017805，分类命名：解淀粉芽胞杆菌(Bacillus.amyloliquefaciens)HZ-12::ndmABCDE, 地址：中国武汉武汉大学。

本发明的另一个目的在于提供了解淀粉芽胞杆菌HZ-12::ndmABCDE在降解咖啡因中的应用。

为了达到上述目的，本发明采取以下技术措施：