[发明专利]一种壳聚糖酶细胞表面展示体系及其制备和应用

说明书

本发明提供了一种壳聚糖酶细胞表面展示体系，将编码壳聚糖酶的基因csn和负责跨膜转运及锚定功能的冰核蛋白N端结构域的基因inaQN融合得到融合后的基因片段，将融合后的基因片段表达在宿主细胞表面，得到壳聚糖酶细胞表面展示体系；所述的基因csn的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述的基因inaQN的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。本发明还提供了上述壳聚糖酶细胞表面展示体系的制备方法。本发明的壳聚糖酶细胞表面展示体系可以直接与溶液中壳聚糖反应，省去了蛋白纯化的繁琐步骤，大大降低了生产低分子量壳聚糖和寡聚壳聚糖的成本。本发明的展示体系在低分子量壳聚糖和寡聚壳聚糖制备领域极具应用前景。

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，涉及一种壳聚糖，具体来说是一种壳聚糖酶细胞表面展示体系及其制备和应用。

背景技术

壳聚糖(chitosan)，是由D-氨基葡萄糖(GlcN)通过β-1,4-糖苷键连接组成的碱性多糖。壳聚糖因其生物相容性良好，在食品、医药、纺织、农业等方面应用及其广泛。壳寡糖又称低聚葡萄糖胺，低聚氨基葡萄糖等，是由壳聚糖经水解产生的一类低聚合度(聚合度一般2-20)可溶于水的氨基糖类化合物。和大分子壳聚糖相比，其分子量小，水溶性良好，易被吸收利用，具有独特的生理活性和功能，被广泛应用于医药、食品、化妆品、农业等领域。

目前，生产壳寡糖的方法有化学降解法、物理降解法以及酶解法。化学降解法反应条件剧烈，降解产物相对分子质量难以控制，且对环境污染较为严重。物理降解法工艺不易控制，所得产物相对分子量偏高，且难以实现工业生产。

市场上常见的是用壳聚糖酶酶解法生产壳寡糖。壳聚糖酶是可以降解壳聚糖的酶，在自然界中分布十分广泛，在细菌和真菌细胞中均有发现。壳聚糖酶主要是从真菌中提取或者通过基因工程菌表达后纯化获得，但无论是从真菌中提取壳聚糖酶或是用细菌在胞内表达或分泌到胞外表达的壳聚糖酶，其纯化步骤都比较繁琐，并且降解壳聚糖时不易与反应产物分离。

细菌细胞表面展示指通过DNA重组技术，将某一具有特定功能的外源蛋白的编码基因与受体细菌细胞表面的锚定单元的编码基因融合后，通过在宿主细胞中表达、分泌，最终融合蛋白跨膜锚定在宿主细胞的表面，达到对融合蛋白功能研究或应用的目的。

发明内容

本发明的目的在于提供一种壳聚糖酶细胞表面展示体系及其制备和应用，所述的这种壳聚糖酶细胞表面展示体系及其制备和应用要解决现有技术中生产壳寡糖的工艺复杂、而且壳聚糖与反应产物难以分离的技术问题。

本发明提供了一种壳聚糖酶细胞表面展示体系，将编码壳聚糖酶的基因csn和负责跨膜转运及锚定功能的冰核蛋白N端结构域的基因inaQN融合得到融合后的基因片段，将融合后的基因片段表达在宿主细胞表面，得到壳聚糖酶细胞表面展示体系；所述的基因csn的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述的基因inaQN的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

进一步的，所述编码壳聚糖酶的基因csn来源于枯草芽孢杆菌，所述宿主细胞为大肠杆菌宿主菌。

本发明还提供了上述的一种壳聚糖酶细胞表面展示体系的制备方法，包括以下步骤：

1)将SEQ ID NO：1所示的编码壳聚糖酶的基因csn和SEQ ID NO：2所示的负责跨膜转运及锚定功能的冰核蛋白N端结构域基因inaQN融合，得到融合后的基因片段；

2)验证融合后的基因片段的序列；

3)将经验证的融合后的基因片段插入IPTG诱导型表达质粒中，得到重组的IPTG诱导型表达质粒；

4)将重组的IPTG诱导型表达质粒转化入宿主菌，使得含有所述重组的IPTG诱导型表达质粒的宿主菌成为所述重组壳聚糖酶细胞表面展示体系；