[发明专利]一种高效率大豆CRISPR/Cas9系统的构建方法及应用

权利要求书

1.一种高效率大豆CRISPR/Cas9系统的构建方法，其特征在于包括以下步骤：

步骤1)人工合成大豆特异的U6启动子序列、Staphylococcus aureus Cas9序列和Streptococcus pyogenes Cas9序列；

步骤2)将扩增目的片段GmU6，sgRNA，35S，N-SpCas9，C-SpCas9，Bar片段构建于实验室改造的pCAMBIA1300骨架载体上，获得以下载体骨架：

GmU6::sgRNA-35S::SpCas9-35S::Bar

GmU6::sgRNA-35S::SaCas9-35S::Bar

GmU6::sgRNA-35S::N-SpCas9-35S::C-SpCas9-35S::Bar

GmU6::sgRNA-35S::N-SaCas9-35S::C-SaCas9-35S::Bar；

步骤3)从SoyBase中选择3个大豆基因以及2个大豆gma-miRNA，根据选定的基因以及miRNA设计靶位点序列，合成两段带有BsaI酶切后形成的粘性末端互补序列的引物，长度为19bp-21bp；

步骤4)将sgRNA靶位点引物退火后形成的带有粘性末端的核心序列，组装于步骤2)所构建的载体；

步骤5)获得完整的大豆CRISPR/Cas9编辑载体。

2.一种根据权利要求1所述的高效率大豆CRISPR/Cas9系统在大豆基因组修饰中的应用。

3.根据权利要求2所述的高效率大豆CRISPR/Cas9系统在大豆基因组修饰中的应用方法，其特征在于包括以下步骤：

(1)将权利要求1中获得的大豆CRISPR/Cas9编辑载体转化K599农杆菌；

(2)侵染大豆子叶，培养获得瞬时转化的大豆根毛；

(3)运用CTAB法提取大豆根毛DNA，测序检测编辑效率。