[发明专利]一种高效率大豆CRISPR/Cas9系统的构建方法及应用

说明书

本发明公开了一种高效率大豆CRISPR/Cas9系统的构建方法及应用，将Staphylococcus aureus Cas9蛋白进行拆分表达，为了提高对大豆基因组的编辑效率及广谱性，构建了大豆SaCas9编辑系统。本发明将一个低效率的编辑系统转变为高效率编辑系统，不仅拓展了编辑大豆基因组的应用广度，也为今后解决农作物基因组编辑效率的问题上提供新思路。

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，尤其涉及一种高效率大豆CRISPR/Cas9系统的构建方法及应用。

背景技术

CRISPR/Cas9是细菌和古细菌在长期演化过程中形成的一种适应性免疫防御，可用来对抗入侵的病毒及外源DNA。CRISPR/Cas9系统通过将入侵噬菌体和质粒DNA的片段整合到CRISPR中，并利用相应的CRISPR RNAs(crRNAs)来指导同源序列的降解，从而提供免疫性。

这个发现纯属偶然，起初也没有引起包括发现者本身太大的重视，甚至这种特征序列都没有一个名字，直到2002年，在通过计算机操作发现很多原核生物(真细菌和古细菌)，都有类似被21-37bp的回文重复序列间隔开的非重复序列后，才正式有了这个顾名思义的名字CRISPR，成簇的、规律间隔的、短回文、重复序列(clustered regularlyinterspaced short palindromic repeats，CRISPR)，并且除了这样的特征序列外，其附近还有一段CRISPR-associated基因，也就是我们后来说的发挥剪切作用和整合外源片段作用的一系列Cas蛋白，CRISPR系统中最重要的3大元件—spacer，repeats，cas等。目前，已经在48％的真细菌和95％的古细菌中发现了CRISPR系统，可以算得上是普遍存在了。

CRISPR/Cas9系统不但丰富了我们对于细菌、古细菌生理机制的认知，更重要的是这种体系的改造利用能带来席卷整个分子生物学领域，更新现有操作模式的一场技术革命。同时，它也为我们打开了一扇窗，从CRISPR的角度重新认识整个微生物世界自我和相互间的调控网络、调控机制，原核及真核细胞间的异同和联系，甚至协同进化的证据。

现在使用的CRISPR/cas 9系统是由最简单的type II CRISPR改造而来的DNA定点剪切工具，该系统由单链的guide RNA和有核酸内切酶活性的Cas 9蛋白构成。通过cas9蛋白形成DNA双链的断裂，而细胞通过NHEJ的修复会造成INDEL效应(insertion anddeletion)，进而造成基因的移码突变而达到基因敲除的目的。此外，还可以通过同源重组等方式达到对基因精确编辑的目的。其实，在此之前已经发展了多种基因的编辑工具，如：ZFN，TALEN等，并且也已经得到广泛应用。CRISPR可谓是2013年生物界的焦点，这项技术相对与ZFN，TALEN等基因编辑技术可以说是既简便又经济，一般的实验室都可以构建自己的平台。

大豆(Glycine max(Linn.)Merr.)是世界重要的粮油兼用作物，也是人类优质蛋白的主要来源。既是我国主要农作物之一，也是我国进口量最大的农产品。大豆是关系国计民生的重要性物资，又是最具经济效益的作物，其延长的产业链和价值链具有很大发展潜力，在农产品贸易领域扮演举足轻重的角色。大豆是人类不可或缺的高蛋白食品、健康植物油及重要保健品的原料。其籽粒含有丰富的蛋白质及脂肪，两者约占干重的60％。大豆是蛋白质含量最高的主要作物，蛋白质一般含量40％，高者达50％。大豆含油量一般18％，高者24％，为世界提供了30％的脂肪和60％的植物蛋白质。

目前运用于大豆基因组编辑的工具甚少，远远满足不了我们对多类型位点且高效率编辑的需求。据已报导的数据显示，2015年SpCas9已经被运用于大豆子叶瞬时转化和稳定遗传转化体系中，但是编辑效率还有待进一步优化。而2016年Cpf1也被运用于大豆原生质体中，但是未在稳定遗传转化体系中验证其编辑效率。因此，开发更高效率更多选择更广运用的CRISPR/Cas9体系，并将其运用于大豆基因组编辑迫在眉睫。

发明内容