[发明专利]一种基于PRET的磷光探针定量检测凝血酶的方法

说明书

本发明公开了一种基于PRET的磷光探针特异性引物定量检测凝血酶的方法。为了提高其灵敏度，本发明在TBA上进行修饰，得到TBA‑BHQ₂探针。利用水热合成法合成的磷光QDs作为能量供体，TBA‑BHQ₂作为能量受体，构成磷光共振转移检测机制，导致磷光猝灭。由于凝血酶适配体与凝血酶之间有较强的结合，从而使MPA包覆的Mn掺杂ZnS磷光量子点与TBA‑BHQ₂混合猝灭体系中的TBA‑BHQ₂离开量子点表面与凝血酶形成新的复合物，从而使体系磷光强度恢复。相对于荧光量子点，磷光量子点因其磷光寿命长、可避免自体荧光和散色光的干扰、选择性强、检测时无需加入任何除氧剂和诱导剂等优点，在检测中运用更加广泛和灵敏。

本专利受到国家自然科学基金面上项目21375095，天津市自然科学基金青年项目（No.17JCQNJC05800），天津师范大学博士基金项目（No.52XB1510）和天津师范大学“无机-有机杂化功能材料化学教育部重点实验室”、“天津市功能分子结构与性能重点实验室”开放基金项目的资助。

技术领域

本发明属于生物分析检测技术领域，主要涉及一种基于PRET的磷光探针对凝血酶定量检测。

背景技术

适配体是一种短的寡核苷酸，它可以折叠成一个独特的三维结构，它能将小的有机分子、蛋白质或细胞作为特定靶点。适配体是由上世纪90年代首次建立由指数富集(SELEX)系统演化而来的。从那以后，适配体已经成为一个值得注意的目标配体和治疗方法。一般来说，适配体的作用与抗体相似，但它在治疗应用方面有优势，特别是在肿瘤学领域。对于实体肿瘤的治疗，抗体的分子质量会阻碍其进入肿瘤的深层部位。相比之下，比抗体(150 kDa)分子量小得多的适配体，其分子量通常在6~30 kDa之间，能更好的进入肿瘤深层部位。重要的是，作为一种高度特异性的配体，适配体由于其体积小、化学和热稳定性好，易于修改和固定，是一种很有吸引力的诊断方法。

在基于适配体的分析方法中，最常见的分子靶点之一是凝血酶（TB）。凝血酶是凝血剂级联的最后一种酶，它将纤维蛋白原转化为不溶纤维蛋白，形成纤维蛋白凝胶。凝血酶在血液中的浓度变化很大，在健康人的血液中几乎不存在。然而，在凝血过程中，它可以达到低微的浓度，甚至在早期的止血过程中也能产生低浓度的凝血酶。凝血酶在多种生命过程中扮演着重要的角色，涉及许多疾病，如血栓栓塞性疾病、炎症反应、心血管疾病和抗凝血疗法。因此，对凝血酶的敏感性检测在临床研究和诊断中具有重要意义。

近年来，室温磷光（RTP）量子点（QDs）检测受到了广泛的关注，已被广泛应用于传感器，特别是生物分子传感器。由于能量转移过程为从三重态（⁴T₁）到基态（⁶A₁），因此，Mn掺杂的ZnS QDs在590 nm处表现出较强的磷光发射。本发明中，用于检测凝血酶的“off-on”磷光传感系统依赖于含磷光QDs和带有BHQ₂染料的特异性凝血酶适配体（BHQ₂-TBA）。QDs作为能量供体，BHQ₂-TBA作为能量受体，构成磷光共振转移（PRET）检测机制。

本发明所用磷光材料与专利ZL201510230335.7（磷光量子点在生物体液和酒中选择性检测谷胱甘肽的应用）、ZL201410140175.2（一种磷光量子点Mn-ZnS的制备方法及铁形态分析中的应用）中所用一致，但是用于检测的体系的物质不一样。

发明内容

本发明的目的在于克服传统荧光量子点的不足，提供基于磷光量子点为探针检测凝血酶的方法。凝血酶适配体（TBA）与凝血酶之间具有较强的特异性结合，