[发明专利]一种用于检测芒果疮痂病病原菌的特异性引物及巢式PCR检测方法

说明书

本发明公开了一种用于检测芒果疮痂病病原菌的特异性引物及巢式PCR检测方法，主要提供了一种用于检测芒果疮痂病病原菌的特异性引物(上游引物P1：5′‑CCCACCCTTTGCTGTTGCG‑3′和下游引物P2：5′‑AAGGCCCCGCGTTTTCG‑3′)，该引物与通用引物ITS1/ITS4配合使用，经过两轮PCR扩增和琼脂糖凝胶电泳，可在芒果疮痂病病原菌基因组DNA或感染芒果疮痂病病原菌的植物组织中特异性地扩增出长度为488bp的特异扩增产物。所发明的特异性引物及其用法可被用于生产实践中芒果疮痂病病原菌的快速、灵敏、特异的检测，对芒果疮痂病的鉴定和防治具有十分重要的意义。

技术领域

本发明涉及微生物检测技术领域，具体涉及一种用于检测芒果疮痂病病原菌的特异性引物及巢式PCR检测方法。

背景技术

芒果疮痂病是由芒果痂囊腔菌(Elsinoe mangiferae)引起的一种植物病害，常危害芒果叶片、幼稍和果实，降低果实商品价值，现已成为我国芒果产区的主要病害之一。我国于1985年发现该病害，1991年，该病在广东省花县造成严重危害，受害果实伤痕累累，基本丧失经济价值。鉴于该病对芒果造成的严重危害和巨大经济损失，该病原菌曾被列为我国对外检疫对象。因此，开展芒果疮痂病病原菌的快速检测，对该病害的早期诊断和及时防治具有十分重要的意义。

目前没有针对芒果疮痂病病原菌的PCR检测方法。传统的芒果疮痂病诊断方法包括症状检查、病菌的显微镜检查，分离培养等。由于芒果疮痂病病原菌比较难分离且生长非常缓慢(该病菌在PDA培养基上25℃下培养两周，菌落直径仅为2.5cm-3.5cm)，所以现有的检测鉴定方法容易导致假阴性，且耗时较长。本发明通过提供一对特异引物对，采用巢式PCR技术对芒果疮痂病病原菌进行检测，灵敏度高，特异性强，国内外尚未见报道。

发明内容

本发明目的在于提供一种用于检测芒果疮痂病病原菌的特异性引物及巢式PCR检测方法。本发明可直接用总DNA为模板进行两轮PCR扩增就能判定有无芒果疮痂病病原菌，方便性得以提高，是一种很有应用前景的病原菌早期快速检测和监测技术，可为芒果疮痂病病原菌引起的植物病害诊断提供有力的技术保障。

本发明采取的技术方案如下：

一种用于检测芒果疮痂病病原菌的特异性引物，包括上游引物P1和下游引物P2，所述P1和P2的序列为：

P1:5′-CCCACCCTTTGCTGTTGCG-3′；

P2:5′-AAGGCCCCGCGTTTTCG-3′。

优选的，所述引物P1和P2对芒果疮痂病病原菌特异性扩增出488bp的产物。

本发明还提供了一种利用所述引物P1和P2检测芒果疮痂病病原菌的巢式PCR方法，具体步骤为：以待测样品的DNA为模板，采用通用引物ITS1/ITS4进行第一轮PCR扩增，将PCR产物稀释50-100倍，再用权利要求1所述的特异性引物P1和P2进行第二轮PCR扩增，反应结束后对扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳分析，根据扩增产物的大小判定结果，如果能特异性地扩增出488bp的产物，即判定样品中存在芒果疮痂病病原菌。

优选的，所述待测样品为芒果疮痂病病原菌或者疑似感染了芒果疮痂病病原菌的植物组织。

优选的，第一轮PCR扩增的反应体系为：2.5μL的10×PCR buffer，0.5μL的Taq DNA聚合酶5U/μL，1μL的引物ITS1，1μL的引物ITS4，2.0μL的dNTPs，1μL的模板DNA，用ddH2O补足至25μL；第二轮PCR扩增的反应体系为：2.5μL的10×PCR buffer，0.5μL的Taq DNA聚合酶5U/μL，1μL的引物P1，1μL的引物P2，2.0μL的dNTPs，1μL的PCR产物，用ddH2O补足至25μL。