[发明专利]催化合成线性ɑ-烯烃生物催化剂OleT-BM3R的序列、制备方法及其应用

权利要求书

1.一种催化合成线性ɑ-烯烃的生物催化剂OleT-BM3R，其特征在于：将咸海鲜球菌（Jeotgalicoccus sp. ATCC 8456）脂肪酸脱羧酶OleT_JE与巨大芽孢杆菌（Bacillusmegaterium）脂肪酸羟化酶CYP102A1（P450BM3）的还原酶结构域融合得到生物催化剂OleT-BM3R，用于催化以脂肪酸为底物生成ɑ-烯烃的反应；所述催化合成线性ɑ-烯烃的生物催化剂OleT-BM3R的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。

2.一种编码权利要求1所述的催化合成线性ɑ-烯烃的生物催化剂OleT-BM3R的多核苷酸，其特征在于：所述核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。

3.一种制备权利要求1所述的催化合成线性ɑ-烯烃的生物催化剂OleT-BM3R的方法，包括如下步骤：

（1）构建表达OleT-BM3R的质粒：将SEQ ID NO:2的核苷酸序列经酶切重组到表达载体上；

（2）将步骤（1）构建的表达OleT-BM3R的质粒转化到大肠杆菌中；

（3）OleT-BM3R的表达：将步骤（2）得到的菌种在LB液体培养基中过夜培养之后，加入TB液体培养基中扩培，于对数期后期加入血红素前体δ-氨基乙酰丙酸和IPTG诱导表达后，离心收菌；

（4）含有OleT-BM3R的细胞裂解液的制备：用缓冲液将步骤（3）中得到的菌体重悬，通过超声破碎裂解细胞，离心，获得上清液；

（5）OleT-BM3R的纯化：将步骤（4）的上清液加入事先预处理的镍离子亲和柱，使带有His标签的目的蛋白与镍柱结合，分别用含10 mM，35 mM咪唑的buffer C 除去杂蛋白，并用buffer B 将OleT-BM3R从柱上洗脱下来；buffer B为0.1 M KPi磷酸钾，0.3 M KCl，250 mM咪唑，pH7.0的缓冲液；buffer C为10 mM或35 mM咪唑，0.1 M KPi磷酸钾，0.3M KCl，pH7.0的缓冲液；

（6）将洗脱下来的目的蛋白透析以除去咪唑，蛋白经浓缩后冻干制成冻干粉，-20℃保存。