[发明专利]催化合成线性ɑ-烯烃生物催化剂OleT-BM3R的序列、制备方法及其应用

说明书

本发明属于蛋白质工程领域，涉及一种利用脂肪酸催化合成线性ɑ‑烯烃的生物催化剂OleT‑BM3R的序列、制备方法及其应用。生物催化剂OleT‑BM3R是将咸海鲜球菌（Jeotgalicoccus sp.ATCC 8456）脂肪酸脱羧酶OleT_JE与巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)脂肪酸羟化酶CYP102A1(P450BM3)的还原酶结构域融合而得。本发明中提供的线性ɑ‑烯烃合成酶OleT‑BM3R利用脂肪酸作为底物、一步实现脱羧的方法具有的优点有：1）反应原料为可再生且易获得的脂肪酸，能够减少线性ɑ‑烯烃合成对石油工业的依赖；2）反应在环保的水溶液中、室温下进行、反应条件温和、低能耗；3）反应催化效率高、稳定性好、底物范围广、反应体系简单。因此在制备线性ɑ‑烯烃方面具有良好的应用前景。

技术领域

本发明属于蛋白质工程领域，通过蛋白质工程改造使一种酶可以有效的利用各种羧酸合成相应的线性ɑ-烯烃，具体地，涉及一种催化合成线性ɑ-烯烃的生物催化剂OleT-BM3R的序列、制备方法及其应用。

背景技术

线性ɑ-烯烃(linear ɑ-olefins,LAOs)是理想的下一代能源物质，并且是合成表面活性剂、润滑油、洗涤剂、添加剂以及聚合物重要的工业原料。因此，LAOs的应用具有广阔的市场前景。目前，LAOs主要是从传统石油工业产品乙烯聚合而成，通过这一方法获得的烯烃均为偶数个碳长，这导致奇数个碳长的烯烃价格异常昂贵。此外，随着日益减少的化石能源的储备，寻求可再生的途径生产烯烃变得尤为迫切。

以在自然界中具有丰富的储备且生物体本身能合成的脂肪酸(FAs)为原料通过脱羧作用合成LAOs是更为直接和便捷的方法。自然界中脂肪酸多以偶数碳为主，通过脱羧就能够直接获得奇数个碳长烯烃，从而填补聚乙烯工业在生产奇数个碳长烯烃的空白。目前已有的以脂肪酸为底物合成相应的LAOs的方法有利用过渡金属催化脱羧的化学合成法，其通常需要剧烈的反应条件，并且需要原位蒸馏保持产物的ɑ选择性，为了激活底物而加入的酸酐会产生多余的废弃物。显然，这种方法并不是一种绿色环保的方法。

2011年发现的咸海鲜球菌(Jeotgalicoccus sp.ATCC 8456)脂肪酸脱羧酶OleT_JE能够利用H₂O₂作为氧化剂和电子供体将饱和脂肪酸脱羧形成末端烯烃。这个仅有一个酶参与、利用脂肪酸作为底物、一步实现脱羧的反应是目前已知最为简单的合成LAOs的酶催化反应。其优点不仅包括脂肪酸原料的易获得性以及反应步骤的简洁性，相较于金属催化的化学合成方法，该反应的突出特点还在于：反应在环保的水溶液中进行、反应条件温和(室温)、低能耗等。但H₂O₂不稳定，易使OleT_JE失活，而且所有依赖H₂O₂的脱羧反应系统普遍具有低催化效率和有限的底物范围。

OleT_JE脱羧反应也可以与其他的氧化还原蛋白系统偶联，能够实现利用空气中的O₂作为氧化剂，生物体中的辅酶NAD(P)H作为电子供体的脂肪酸的脱羧产末端烯烃反应。但是目前已知的耦联氧化还原蛋白的催化系统也都存在催化效率低，底物范围有限，以及复杂的反应体系导致的操作繁琐等问题，因而限制了它们的应用前景。

发明内容

为了降低线性ɑ-烯烃合成对石油工业的依赖，弥补现有工业方法无法生产奇数碳链长度线性ɑ-烯烃的缺陷，克服基于金属催化剂化学合成线性ɑ-烯烃方法高能耗、反应体系条件剧烈、产生不利于环境的废料等问题，以及解决现有酶反应体系产率低、底物范围窄、反应体系复杂等问题，本发明的第一个目的在于提供一种催化效率高，底物范围广，反应体系更简洁的催化合成线性ɑ-烯烃的生物催化剂脂肪酸脱羧酶OleT-BM3R。

本发明的第二个目的是提供该脂肪酸脱羧酶的氨基酸序列和核苷酸序列。

本发明的第三个目的是提供制备该脂肪酸脱羧酶的方法。