[发明专利]一种简单快速的芽孢分离纯化方法

说明书

本发明提供一种简单快速的芽孢分离纯化方法，通过对芽孢和细菌菌体的混悬液进行分散、分层沉淀、选择性悬浮细菌菌体和分离细菌菌体悬浮液与芽孢沉淀层来达到从混悬液中分离纯化芽孢的目的。本方法与现有芽孢分离纯化方法相比，操作更简单，分离纯化的速度更快，不使用任何化学试剂、酶和超声等复杂或可能对芽孢质量造成影响的操作，制备的芽孢悬浮液纯度可达到99％以上。

技术领域

本发明涉及微生物学技术领域，具体涉及一种简单快速的芽孢分离纯化方法。

背景技术

芽孢是某些细菌(芽孢杆菌，梭状芽孢杆菌，少数球菌等)在其生长发育后期，在细胞内形成的一个圆形或椭圆形，厚壁，含水量低，抗逆性强的休眠体构造。芽孢的诸多特性吸引了越来越多的学者对其进行研究。而进行芽孢相关研究的第一步就是制备纯净的芽孢悬浮液。

很多学者在其研究芽孢的文章里介绍了自己制备芽孢悬浮液的方法。可分为两类，第一类是将细菌菌体和芽孢悬浮于无菌蒸馏水中，细菌菌体在蒸馏水中无法进行正常的生理代谢活动从而自然死亡解体成菌体碎片，再通过离心并倾倒上清液的方法将菌体碎片从混悬液中去除从而得到纯净的芽孢。取决于细菌菌体数量、死亡解体的速度和程度，此方法通常需要对混悬液进行几次至几十次的离心，耗时几天到十几天。且根据文章所述，此方法并不能制得很纯净的芽孢悬浮液。所以该方法不仅费时费力，所制的芽孢悬液纯度还不高。第二类方法是先将芽孢和细菌菌体悬浮于溶菌酶溶液或溶菌酶和胰蛋白酶的混合溶液中，通过酶解作用将细菌菌体破裂成菌体碎片，再通过离心并倾倒上清液的方法将菌体碎片从混悬液中去除从而得到纯净的芽孢。取决于细菌菌体的数量、酶解液的浓度和酶解温度，此方法通常需要先酶解几十分钟到几个小时，然后再进行若干次离心才能制得较纯净的芽孢，耗时几个小时到十几个小时，而且此方法步骤繁多且操作复杂。同时一些学者的研究表明溶菌酶，在低浓度下(10mg/L)，会导致芽孢萌发；在高浓度下(100mg/L)，不仅会水解皮层，还会快速水解芽孢壁，引起芽孢内膜破裂，造成胞内物质直接泄漏。本研究组在进行相关实验时也发现，在制备芽孢悬浮液的过程中如果使用溶菌酶对细菌菌体进行酶解，制得的芽孢在后续的诱导萌发生长过程中，只萌发但不生长。此方法通过酶解作用破裂菌体细胞，大大缩短了细菌菌体破裂成菌体碎片的时间，且制得的芽孢悬液纯度较高。但是溶菌酶可能会对芽孢的质量造成影响。

发明内容

本发明的目的是提供一种简单快速的高质量芽孢分离纯化方法。本发明提供的芽孢分离纯化方法，是利用芽孢和细菌菌体因密度不同，导致离心后会分层沉淀的原理，经振荡和离心分层沉淀后，再选择性将沉淀层中的细菌菌体重新悬浮于蒸馏水中而保持芽孢沉淀层完整，从而达到对芽孢进行分离纯化的目的。此方法通常需要对混悬液进行三到五次离心，耗时四到六小时。与现有方法相比，不仅操作更简单，分离纯化的速度更快，耗时更短，不使用任何化学试剂、超声等复杂处理或可能对芽孢质量造成影响的操作，分离纯化的芽孢质量不受影响且纯度较高。

本发明技术方案如下：

一种简单快速的芽孢分离纯化方法，包括以下步骤：

1)将含芽孢和细菌菌体的混悬液收集到无菌的离心容器中；

2)分散粘连在一起的细菌菌体和芽孢并使其悬浮于混悬液中；使芽孢和细菌菌体沉淀于所述离心容器底部，分别形成芽孢沉淀层和细菌菌体沉淀层；移除上清液；

3)再缓慢加入适量的悬浮介质，以不破坏所述芽孢沉淀层为准；使细菌菌体重新悬浮于所述悬浮介质中而芽孢沉淀层保持完整；移除上层含细菌菌体的悬浮液；

4)向所述离心容器内重新加入适量的悬浮介质；

5)重复步骤2)-4)，直至所述芽孢沉淀层中芽孢纯度满足要求。

如果芽孢的纯度满足要求，则可加入少量0-4℃的无菌蒸馏水制成芽孢悬浮液进行低温保藏。