[发明专利]一种快速检测油脂或生物样品中的维生素D的方法

说明书

本发明涉及一种快速检测油脂或生物样品中的维生素D的方法，本发明中，将待测样品使用多维色谱系统进行维生素D样品的在线预处理和分离；其中，所述多维色谱系统包括依次连接的超临界色谱部分及反相液相色谱部分，所述反相液相色谱部分中包括一个或一个以上的反相液相色谱柱；所述超临界色谱部分包括超临界流动相、改性剂和超临界用填料柱。

技术领域

本发明涉及一种从油脂或生物样品中维生素的分离、检测方法和系统，属于天然物质的分离领域。

背景技术

维生素D₂(也被称为麦角钙化醇)和维生素D₃(胆钙化醇)是脂溶性维生素，它们在钙代谢中起着非常重要的作用。维生素D也影响其他代谢途径。缺乏维生素D可导致严重的疾病，如佝偻病和骨骼减弱。通常，使用维生素D补充剂用于治疗或预防维生素缺乏症。维生素D也被添加到婴儿配方奶粉，以满足婴儿的营养需求。但值得注意的是，过量摄入维生素D也可能是危险的。因此，在维生素补充剂和婴儿配方食品中合适地使用维生素D在医疗和保健上都起着非常重要的作用。

由于维生素D含量较低，易受基质干扰，因此在检测前，样品溶液制备过程通常包括皂化、萃取等步骤。传统上，维生素D测定的现有程序一般需要使用溶剂从油性或脂肪基质中萃取，然后通过正相液相色谱(NPLC)进行清洁，进而经过反相液相色谱柱(RPLC)进行分离和检测。由于传统的基于溶剂的提取技术首先是耗时，也需要密集的劳动，并且消耗了大量的有机溶剂，因此也进行了许多尝试，以简化的样品制备过程。

为了分析婴儿配方奶粉中的维生素D，开发了两种反相液相色谱的二维柱切换系统用于在线清除提取物。引用文献1公开了一种在线二维液相色谱法同时测定婴幼儿和成人配方营养品中的维生素A、D₃和E的方法，其一维和二维分离均基于反相色谱。样品经过皂化、萃取后，直接进样分析，一次进样即可在线完成样品中各维生素的定量分析。但是，使用RPLC清洗从油状物或脂质的基体中提取的样品的过程会使得一些强疏水性的脂溶性杂质保留在RPLC柱中。杂质积累在色谱柱中，不仅会导致检测物保留时间的改变，而且还会导致清洁柱的寿命缩短。

在另一方面，高效液相色谱法/超高效液相色谱-质谱(HPLC/UPLC-MS)使用更加简单的样品制备方法已被开发用于在油性维生素补充剂、婴儿配方奶粉或生物流体中的维生素D分析。但是，通常情况下这样的方法仍然需要离线溶剂萃取过程或正相固相萃取(SPE)处理以对样品进行预处理或成分清理。引用文献2涉及利用UPLC-MS/MS建立了一种快速、灵敏的、能够同时测定婴幼儿配方奶粉中脂溶性维生素A、D₂、D₃、α-生育酚的分析方法。但对于检测样品，仍然需要经过碱性无机物的处理以及有机溶剂的提取，在前处理的简便性方面还有改进或提高的余地。

此外，为了获得高效率的自动分析系统，仍然需要基于正相液体在线纯化油性或脂肪样品的色谱法。然后，可以使用反相液相色谱分析分离较少的脂肪洗脱液以提供更好的分辨率。然而，由于两种不同类型的流动相的不匹配性，难以构建柱切换系统以同时包括正相和反相液相色谱。

此外，随着超临界流体技术的发展，也尝试了使用超临界萃取或超临界色谱分析法对物质进行提取或分离。在超临界技术中对于维生素D分离和分析中具有与NPLC相类似的保留时间和分离行为。引用文献3公开了用柱色谱从与其它组分如脱氢胆固醇，速甾醇和光甾醇的混合物中分离维生素D₃或前维生素D₃的方法，所述色谱柱中的流动相为超临界二氧化碳。但是该方法仅涉及合成维生素D产品后的分离或提纯。

可见，在现有技术中，对于从油脂或生物样品等成分复杂的体系中提取维生素D的方法在应用的便捷性、环保型、快速性等方面的改进不能说是充分的。

引用文献1：

“在线二维液相色谱法同时测定婴幼儿和成人配方营养品中的维生素A、D₃和E”，张艳海，《色谱》，2015年3月

引用文献2：