[发明专利]一种用于烟草脉斑病中烟草花叶病毒属鉴别诊断的试剂盒及其检测方法

权利要求书

1.一种用于烟草脉斑病中烟草花叶病毒属鉴别诊断的试剂盒，其特征在于，包括两条特异性引物：

SPLVGV-1：5’-GGAAAAGYGGTGATGTRACWACG-3’；

SPLVGV-2：5’-GAACAGTTTKGCCTCSSSTTCCAA-3’。

2.根据权利要求1所述试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括M-MLV反转录酶、M-MLV酶反应缓冲液、dNTPs、Taq DNA聚合酶、Mg2⁺和PCR反应缓冲液。

3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括标准阳性模板。

4.一种用于烟草脉斑病中烟草花叶病毒属鉴别诊断的检测方法，其特征在于，其包括以下步骤：

(1)提取待测样品总RNA；

(2)设计并合成引物；

(3)RT-PCR

a.反转录合成cDNA，以甘薯总RNA为模板，以SPLVGV-2引物，通过反转录酶合成cDNA

b.PCR扩增，以cDNA为模板，以SPLVGV-1和SPLVGV-2为引物，进行PCR反应；

(4)电泳检测

吸取2.5μL RT-PCR产物进行0.8-1.5％的琼脂糖凝胶电泳，经核糖染色Goldview，通过凝胶成像仪观察，在感染该烟草脉斑病病毒的甘薯样品中有895bp的核酸条带。

5.根据权利要求4所述的检测方法，其特征在于，所述步骤(1)中总RNA提取法采用的是多糖多酚植物组织的裂解法。

6.根据权利要求4所述的检测方法，其特征在于，所述步骤(3)中PCR扩增阶段的反应条件为：94℃预变性5min；94℃变性1min；54℃退火1min；72℃延伸1min，共进行35个循环，72℃延伸7min，4℃保存。