[发明专利]一种用于烟草脉斑病中烟草花叶病毒属鉴别诊断的试剂盒及其检测方法

说明书

本发明公开了一种用于烟草脉斑病中烟草花叶病毒属鉴别诊断的试剂盒，包括两条特异性引物，所述试剂盒还包括M‑MLV反转录酶、M‑MLV酶反应缓冲液、dNTPs、Taq DNA聚合酶、Mg2⁺和PCR反应缓冲液。本发明还提供一种烟草脉斑病病毒的检测方法，其包括以下步骤：(1)提取待测样品总RNA，(2)设计并合成引物，(3)RT‑PCR，(4)电泳检测。本发明提供了一种用于烟草脉斑病中烟草花叶病毒属鉴别诊断的试剂盒与检测方法，利用RT‑PCR方法检测烟草脉斑病中烟草花叶病毒属，克服了分离烟草病毒核酸的繁琐步骤，节省时间，大大提高了检测的可操作性、灵敏性和可重复性，为烟草脉斑病病毒的防治、脱毒苗的检测提供了有效方法。

技术领域

本发明属于植物病毒检测技术领域，具体涉及一种用于烟草脉斑病中烟草花叶病毒属鉴别诊断的试剂盒及其检测方法。

背景技术

烟草脉斑病主要由马铃薯Y病毒Potato virus Y(PVY)侵染引起，常与黄瓜花叶病毒Cucumber mosaic virus(CMV)、烟草蚀纹病毒Tobacco etch virus (TEV)、烟草脉斑驳病毒Tobacco vein mottle virus(TVMV)、烟草坏死病毒 Tobacco necrosis virus(TNV)等病毒中的1个或多个复合侵染烟株。烟草脉斑病样品中的病毒分别属于烟草花叶病毒属Tobamovirus、马铃薯Y病毒属 Potyvirus和马铃薯卷叶病毒属Polerovirus。

由于烟草脉斑病样品中存在多种病毒复合侵染的现象，采用传统的血清学、 PCR等方法对症状表现明显的烟草病毒病原进行鉴定不能完整地反映样品中的病毒，故亟需一种用于烟草脉斑病中烟草花叶病毒属鉴别诊断的试剂盒及其检测方法。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种用于烟草脉斑病中烟草花叶病毒属鉴别诊断的试剂盒与检测方法。

技术方案：本发明所述的一种用于烟草脉斑病中烟草花叶病毒属鉴别诊断的试剂盒，包括两条特异性引物：

SPLVGV-1：5，-GGAAAAGYGGTGATGTRACWACG-3，；

SPLVGV-2：5，-GAACAGTTTKGCCTCSSSTTCCAA-3，。

进一步的，所述试剂盒还包括M-MLV反转录酶、M-MLV酶反应缓冲液、dNTPs、 TaqDNA聚合酶、Mg2+和PCR反应缓冲液。

进一步的，所述试剂盒还包括标准阳性模板。

本发明中还提供一种烟草脉斑病病毒的检测方法，其包括以下步骤：

(1)提取待测样品总RNA；

(2)设计并合成引物；

(3)RT-PCR

a.反转录合成cDNA，以烟草总RNA为模板，以SPLVGV-2引物，通过反转录酶合成cDNA

b.PCR扩增，以cDNA为模板，以SPLVGV-1和SPLVGV-2为引物，进行PCR 反应；

(4)电泳检测

吸取2.5μL RT-PCR产物进行0.8-1.5％的琼脂糖凝胶电泳，经核糖染色Goldview，通过凝胶成像仪观察，在感染该烟草脉斑病病毒的烟草样品中有 895bp的核酸条带。

进一步的，所述步骤(1)中总RNA提取法采用的是多糖多酚植物组织的裂解法。

进一步的，所述步骤(3)中PCR扩增阶段的反应条件为：94℃预变性5min； 94℃变性1min；54℃退火1min；72℃延伸1min，共进行35个循环，72℃延伸 7min，4℃保存。