[发明专利]一种酶法合成丹参素的方法

权利要求书

1.一种酶法合成丹参素的方法，其特征在于，所述方法是以左旋多巴为底物，通过酪氨酸解氨酶、苯丙酮酸还原酶和葡萄糖脱氢酶催化生产丹参素；具体包括如下步骤：

(1)酪氨酸解氨酶、苯丙酮酸还原酶和葡萄糖脱氢酶的异源表达：分别构建酪氨酸解氨酶、苯丙酮酸还原酶和葡萄糖脱氢酶的基因工程菌，经发酵分别制得表达酪氨酸解氨酶、苯丙酮酸还原酶和葡萄糖脱氢酶的菌体：酪氨酸解氨酶湿菌体、苯丙酮酸还原酶湿菌体和葡萄糖脱氢酶湿菌体；

(2)然后将左旋多巴0.5-1.5mol、酪氨酸解氨酶湿菌体10-30g/L、苯丙酮酸还原酶湿菌体10-30g/L、葡萄糖脱氢酶湿菌体10-30g/L置于反应器中混合均匀，调节pH值为7.0，温度为30℃，催化反应16-20h，得到丹参素。

2.根据权利要求1所述的酶法合成丹参素的方法，其特征在于，催化0.5-1.5mol底物左旋多巴需要酪氨酸解氨酶湿菌体15-20g/L、苯丙酮酸还原酶湿菌体15-20g/L、葡萄糖脱氢酶湿菌体15-20g/L。

3.根据权利要求1所述的酶法合成丹参素的方法，其特征在于，所述酪氨酸解氨酶选自类球红细菌。

4.根据权利要求1所述的酶法合成丹参素的方法，其特征在于，所述苯丙酮酸还原酶选自干酪乳杆菌。

5.根据权利要求1所述的酶法合成丹参素的方法，其特征在于，所述葡萄糖脱氢酶选自巨大芽孢杆菌。

6.根据权利要求1所述的酶法丹参素的方法，其特征在于，所述步骤(1)具体如下：

(a)构建酪氨酸解氨酶载体：

利用BamHI和XhoI分别将TAL-made基因和pET28a载体双酶切，然后二者进行连接构建得到重组表达酪氨酸解氨酶的质粒pET28a-TAL-made；

(b)构建苯丙酮酸还原酶载体：

利用BamHI和XhoI分别将PPR-made基因和pET28a载体双酶切，然后二者进行连接构建得到重组表达苯丙酮酸还原酶的质粒pET28a-PPR-made；

(c)构建葡萄糖脱氢酶载体：

利用BamHI和XhoI分别将GDH-made基因和pET28a载体双酶切，然后二者进行连接构建得到重组表达葡萄糖脱氢酶的质粒pET28a-GDH-made；

(d)分别构建酪氨酸解氨酶、苯丙酮酸还原酶和葡萄糖脱氢酶的基因工程菌；

将质粒pET28a-TAL-made、pET28a-PPR-made和pET28a-GDH-made分别转入E.coliBL21，得到分别重组表达酪氨酸解氨酶、苯丙酮酸还原酶和葡萄糖脱氢酶的菌株BL21-TAL、BL21-PPR和BL21-GDH；

(e)将菌株BL21-TAL在发酵培养基中培养，加入0.1-0.5％的乳糖25-30℃诱导表达16h，离心收集菌体即得所述酪氨酸解氨酶表达菌体；

将菌株BL21-PPR在发酵培养基中培养，加入0.1-0.5％的乳糖25-30℃诱导表达16h，离心收集菌体即得所述苯丙酮酸还原酶表达菌体；

将菌株BL21-GDH在发酵培养基中培养，加入0.1-0.5％的乳糖25-30℃诱导表达16h，离心收集菌体即得所述葡萄糖脱氢酶表达菌体。

7.根据权利要求6所述的酶法合成丹参素的方法，其特征在于，所述发酵培养基配方为：葡萄糖2％、硫酸铵0.3％、蛋白胨0.5％、酵母浸粉2％、KH₂PO₄1.25％、MgSO₄0.1％、柠檬酸0.15％和乳糖0.1-0.5％，发酵条件：pH7.0，温度37℃，诱导后降温至25-30℃，发酵结束后再以6000rpm转速离心10min，-20℃保存菌体备用。