[发明专利]一种酶法合成丹参素的方法

说明书

本发明公开了一种新型的合成丹参素合成方法，所述方法是利用酪氨酸解氨酶酶、苯丙酮酸还原酶和葡萄糖脱氢酶催化左旋多巴生产丹参素。具体是将左旋多巴(3，4‑二羟基苯基丙氨酸)0.5‑1.5mol、酪氨酸解氨酶湿菌体10‑30g/L、苯丙酮酸还原酶湿菌体10‑30g/L、葡萄糖脱氢酶湿菌体10‑30g/L置于反应器中混合均匀，调节pH值为7.0，温度为30℃，催化反应16‑20h，得到丹参素。该方法首次利用酪氨酸解氨酶、苯丙酮酸还原酶和葡萄糖脱氢酶，以左旋多巴为底物酶法生产丹参素，节省原料，避免了化学合成的污染。

技术领域

本发明属于生物合成技术领域，具体涉及一种酶法合成丹参素的方法。

背景技术

丹参素，化学名为β-(3，4-二羟基苯基)乳酸，因其为中药材丹参的有效成分，故命名为丹参素，药理学研究发现，丹参素具有缩小心肌梗死范围和减轻病程的作用，同时对心肌缺血，再灌注损伤具有保护作用，能够清除外源性氧自由基，保护线粒体的功能；而且丹参素能明显抑制血小板的聚集，对冠心病有效，有助于机体组织的康复和成人呼吸窘迫综合征等严重并发症的纠正；丹参素在抗菌消炎及增强机体免疫功能方面也有一定的功效，在临床上对感染性休克患者应用丹参素，可提高生存率；大量的临床研究也发现丹参素能够抑制细胞内源性胆固醇的合成，可用于动脉粥样硬化的防治；丹参素可通过对血小板释放物及凝血酶原的影响，抑制其聚集，降低血液的凝固性而起到活血化淤的作用。另外丹参素对增生性疤痕、扩张冠状动脉、肝损伤、抗脑缺血损伤、肺心病、肿瘤、高原病、银屑病都有一定的治疗作用。综上所述，丹参素具有很大的市场潜力。目前丹参素的生产主要有植物提取和化学合成两种方法，植物提取以丹参药材为原料，经过粉碎、加水浸泡、煎煮，提取液浓缩后利用乙醇沉淀，乙醚萃取，水相经过盐析获得。该方法的主要缺点在于提取过程中过高的乙醇浓度降低了丹参素的活性成分，尽管很多的研究促进了方法的改进，但是原材料的限制成了制约其生产规模的最大因素。化学合成法最早起源于Harington等人在1931年的报道，他们通过将乙烯酮化合物乙酰化的方法获得丹参素，该方法可以分别以甘氨酸或者反式肉桂酸为原料，但是其步骤繁琐，中间产物多，环境污染严重。因此开发新的丹参素合成方法至关重要，目前利用重组微生物技术进行丹参素的合成仅见一例报道，该报道以预苯酸为前体，利用对羟基苯乙酸间位羟基化酶和D-乳酸脱氢酶催化合成丹参素，随着研究的深入，重组微生物技术生产丹参素因其效率高、低污染、成本低将备受关注，而选择反应的关键酶，并高效表达是成败的关键。

发明内容

本发明的目的在于提供一种新的酶法合成丹参素的方法，用以解决现有技术中原材料紧缺的问题，该方法效率高、低污染、成本低。

为实现上述目的，本发明采取如下技术方案：

本发明以左旋多巴为底物，通过酪氨酸解氨酶(TAL)、苯丙酮酸还原酶(PPR)和葡萄糖脱氢酶(GDH)催化生产丹参素，其中葡萄糖脱氢酶用于NADH的再生，避免了NADH的添加。具体如下：

以酪氨酸解氨酶催化3，4-二羟基苯基丙氨酸生成3，4-二羟基苯基丙酮酸，然后在苯丙酮酸还原酶催化下还原生成丹参素(3，4-二羟基苯基乳酸)。其中，3，4-二羟基苯基丙酮酸在苯丙酮酸还原酶催化下还原生成丹参素的过程中，会同时产生NAD，并需要辅酶NADH，但是NADH存在价格昂贵的问题。所以针对这个问题，通过加入葡萄糖脱氢酶用于NADH的再生，原因在于，由于在整个的反应体系中存在葡萄糖，加入葡萄糖脱氢酶可以使其在产生葡萄糖酸的过程中同时以NAD为辅酶产生NADH，形成循环的辅酶再生系统，不需要再额外添加NADH，解决了NADH价格昂贵的问题。具体反应过程如下：

优选地，所述酪氨酸解氨酶来自于类球红细菌(Rhodobacter sphaeroides)，但不局限于此菌，该菌中所含的酪氨酸解氨酶能够催化苯丙氨酸和酪氨酸的脱氨。并且以该菌的酪氨酸解氨酶为模板，密码子优化后可以合成在大肠杆菌中表达的酪氨酸解氨酶基因TAL-made。