[发明专利]CRISPR-Cas9靶向敲除人肠癌细胞PPP1R1C基因及其特异性的sgRNA

权利要求书

1.一种CRISPR/Cas9靶向敲除人肠癌细胞PPP1R1C基因及其特异性的sgRNA，其特征在于，首先设计获得特异性靶向PPP1R1C基因功能区的sgRNA；其次构建PPP1R1C基因的sgRNA到慢病毒载体系统；然后将此慢病毒载体系统感染人肠癌HT-29细胞，得到的PPP1R1C基因敲除细胞株。

2.根据权利要求1所述的特异性靶向PPP1R1C基因功能区的sgRNA，其DNA序列如SEQ IDNO.1所示，所述sgRNA在PPP1R1C基因上的靶序列是唯一的。

3.根据权利要求2所述的特异性靶向PPP1R1C基因功能区的sgRNA，其引物包括：

针对PPP1R1C基因的靶点的引物对：

PPP1R1CsgRNAoligo1：如SEQ ID NO.2所示；

PPP1R1CsgRNAoligo2：如SEQ ID NO.3所示。

4.根据权利要求1所述的构建PPP1R1C基因的sgRNA到慢病毒载体系统，是一种靶向敲除PPP1R1C基因的CRISPR/Cas9重组表达慢病毒载体Lenti-CRISPRv2-hPPP1R1Csg，其特征在于：含有特异性靶向PPP1R1C基因的sgRNA和Cas9蛋白的重组表达载体。

5.根据权利要求4所述的重组表达载体的骨架载体的序列如序列表中SEQ ID NO.8所示。

6.根据权利要求1所述的CRISPR/Cas9靶向敲除人肠癌细胞PPP1R1C基因及其特异性的sgRNA，其特征在于包括如下步骤：

(1)提供sgRNA序列，所述sgRNA在PPP1R1C基因上的靶序列符合5’-N(19)G的序列排列规则，所述sgRNA在PPP1R1C基因上的靶序列位于基因的外显子，所述sgRNA在PPP1R1C基因上的靶序列位于不同的各种剪切形式的共有外显子上，所述sgRNA在PPP1R1C基因上的靶序列是唯一的，并且所述sgRNA在PPP1R1C上的靶位点序列如序列表SEQ ID NO.1序列所示，在所述sgRNA在PPP1R1C上的靶位点序列的5’-端加上CACCG序列合成得到正向寡核苷酸即Forward oligo；获得sgRNA在PPP1R1C上的靶位点序列的互补链，并且在互补链的5’-端加上AAAC序列、3’-端加上C，合成得到反向寡核苷酸即Reverse oligo；将合成的1对互补的sgRNA寡聚核苷酸的Forward oligo和Reverse oligo成对变性、退火，退火之后形成可以连入U6真核表达载体的双链sgRNA寡聚核苷酸；

(2)线性化序列如序列表SEQ ID NO.8所示的Lenti-CRISPRv2质粒；将退火的双链sgRNA寡聚核苷酸与线性化的携带Cas9基因的表达载体Lenti-CRISPRv2连接获得携带含相应靶序列的sgRNA寡聚核苷酸和Cas9基因的表达载体Lenti-CRISPRv2-hPPP1R1Csg质粒，转化感受态细菌并涂Amp+平板，挑取单克隆并用通用引物U6通过测序鉴定出阳性克隆，并对所述阳性克隆摇菌、提取质粒；

(3)用所述携带有sgRNA寡聚核苷酸和Cas9基因的序列为SEQ ID NO.9的表达载体Lenti-CRISPRv2-hPPP1R1Csg质粒、序列为SEQ ID NO.10和SEQ ID NO.11的pLP-VSVG(AddGene 8454)and psPAX2(AddGene 12260)包装质粒和包装细胞系，包装细胞系为293TN细胞。包装出同时携带靶向PPP1R1C基因的sgRNA和Cas9的假型慢病毒；

(4)使用所述假型慢病毒感染目的细胞，加puromycin抗性筛选后并进一步培养；

(5)铺单克隆细胞，然后收集单克隆细胞，抽提基因组DNA，以其基因组DNA为模板扩增包含所述靶序列的基因片段，TA克隆测序确认PPP1R1C基因已经被敲除并获得基因敲除的细胞。

7.根据权利要求1所述的敲除PPP1R1C基因的细胞株，为人HT-29细胞；其特征在于：是HT-29细胞中的PPP1R1C基因缺失或插入核苷酸得到的细胞株，为如下的细胞株13#和14#中的任一株：细胞株13#是：sgRNA的切割位点位于在野生型PPP1R1C基因上的sgRNA PAM区前3个碱基处，导致PPP1R1C基因的外显子增加1个碱基；细胞株14#：是sgRNA的切割位点位于在野生型PPP1R1C基因上的sgRNA PAM区前2个碱基处，导致PPP1R1C基因的外显子缺失14个碱基。