[发明专利]CRISPR-Cas9靶向敲除人肠癌细胞PPP1R1C基因及其特异性的sgRNA

说明书

本发明公开了CRISPR/Cas9靶向敲除人肠癌细胞PPP1R1C基因及其特异性sgRNA序列。首先是获得特异性靶向PPP1R1C基因功能区的sgRNA，其碱基序列如SEQ ID NO.1所示；其次是构建PPP1R1C基因的sgRNA到慢病毒载体系统，该系统含有Cas9蛋白；最后将含有该sgRNA的CRISPR/Cas9慢病毒感染人肠癌HT‑29细胞，获得PPP1R1C蛋白表达水平显著降低的细胞株。本发明具有操作步骤简单、sgRNA靶向性好、对PPP1R1C基因切割效率高；且所构建的CRISPR/Cas9慢病毒系统具有敲除效率高并能特异性敲除PPP1R1C基因，得到敲除PPP1R1C基因的人肠癌细胞，从而为进一步研究肠癌细胞中PPP1R1C的作用机制提供强有力的工具。

技术领域

本发明属于基因工程领域，更具体地说涉及CRISPR/Cas9靶向敲除人肠癌细胞PPP1R1C基因及其特异性的gRNA。

背景技术

蛋白质磷酸酶1(PP1)具有丝氨酸/苏氨酸磷酸酶的活性，广泛参与细胞信号转导过程。蛋白激酶和蛋白磷酸酶能够使多种蛋白质磷酸化和去磷酸化，从而改变酶、受体和离子通道蛋白质电荷、溶解性和结合能力等，它们广泛参与细胞分裂、基因表达调控、神经信息传递、肌肉收缩和细胞信号转导等重要生命过程。蛋白磷酸酶PP1和PP2A活性受损会导致细胞功能障碍，如发生肿瘤、神经元分化异常等。蛋白磷酸酶1调节抑制亚基1C(proteinphosphatase 1regulatory inhibitor subunit 1C，PPP1R1C)又被称作IPP5，是一个新型的蛋白磷酸酶1(PP1)抑制因子，在其高度保守的N-端有一个PP1结合模体和一个PP1抑制模体，并且其本身受磷酸化作用调控。人PPP1R1C基因位于染色体2q31.3-q32.1，其表达的蛋白广泛分布于心脏、睾丸及肝脏等器官。

肠癌是指发生于肠道的癌病类疾病，是胃肠道中常见的恶性肿瘤，发病率仅次于胃癌和食管癌。目前，研究人员在肠癌的发生机制方面做了大量研究，发现了众多参与肠癌进展的途径和机制，如原癌基因激活、抑癌基因失活(点突变、重排、缺失)及染色体异常等，但目前肠癌发生与进展中所涉及的分子机制仍有许多尚未明确，需要进一步研究。

CRISPR/Cas系统是最近几年兴起用于靶向基因特定DNA修饰的重要工具，具有快速、高效及特异性靶向等优势，已被应用于多种模式生物，包括人、小鼠、大鼠、斑马鱼、秀丽隐杆线虫、植物及细菌。CRISPR RNA(crRNA)与转录激活crRNA退火形成的复合物能特异识别基因组序列，引导Cas9核酸内切酶在目的片段生成DNA双链断裂。这个识别复合体可以通过融合crRNA与tracrRNA序列形成sgRNA进行简化。基因组的靶序列中有长约20bp的片段与crRNA或sgRNA互补配对；靶序列末端的三核苷酸区域PAM(5’-NGG-3’)为spCas9识别位点，是实现剪切功能的关键。sgRNA能否做到特异性、精确靶向目标基因是CRISPR/Cas9特异性敲除目标基因的先决条件，脱靶和错误靶向都会影响CRISPR/Cas9对目标基因的特异性敲除，因此，能够设计、制备出精确性和特异性靶向目标基因的sgRNA成为CRISPR/Cas9基因敲除的关键技术。

本发明利用CRISPR/Cas9慢病毒系统，获得敲除PPP1R1C基因的人肠癌细胞，为研究肠癌细胞中PPP1R1C的作用机制提供有力工具。

参考文献：

1)Bensaid M,Gary-Bobo M,Esclangon A,Maffrand J P,Le Fur G,Oury-Donat Fand Soubrie P,2003.The cannabinoid CB1receptor antagonist SR141716increasesAcrp30mRNA expression in adipose tissue of obese fa/fa rats and in culturedadipocyte cells.Molecular Pharmacology,63(4):908～914