[发明专利]一种提高芽胞杆菌甘油代谢增加聚γ-谷氨酸产量的方法

权利要求书

1.一种提高芽胞杆菌甘油代谢增加聚γ-谷氨酸产量的方法，其特征在于：步骤包括：在芽胞杆菌中强化表达黄素腺嘌呤二核苷酸合成途径中的关键基因，即在芽孢杆菌中强化表达黄素腺嘌呤二核苷酸的合成加速甘油代谢，以提高聚γ-谷氨酸产量；

所述芽胞杆菌为产聚γ-谷氨酸的地衣芽胞杆菌WX-02，该菌保存于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCNO：M208065；

所述关键基因为ribE、ribF中的一种，所述基因ribE核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:1所示，所述基因ribF核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:2所示。

2.根据权利要求1所述的提高芽胞杆菌甘油代谢增加聚γ-谷氨酸产量的方法，其特征在于：所述在芽胞杆菌中强化表达黄素腺嘌呤二核苷酸合成途径中的关键基因的步骤包括：

S1、黄素腺嘌呤二核苷酸强化表达载体构建：扩增关键基因ribE、ribF中的一种、P43启动子和终止子TamyL，并将其重组到一起构成P43-ribE–TamyL、P43-ribF–TamyL，与载体连接得到黄素腺嘌呤二核苷酸强化表达载体pHY-ribE、pHY-ribF；

S2、黄素腺嘌呤二核苷酸强化表达菌株构建：将表达载体pHY-ribE、pHY-ribF转入芽胞杆菌，以四环素抗性作为筛选标记，筛选得到阳性转化子，PCR验证筛选得到过表达ribE、ribF中一种的芽胞杆菌。

3.根据权利要求2所述的提高芽胞杆菌甘油代谢增加聚γ-谷氨酸产量的方法，其特征在于：步骤S1中，将P43-ribEF–TamyL、P43-ribF–TamyL与质粒载体连接，转化DH5α，采用验证引物对转化子进行菌落PCR验证，并对阳性转化子克隆抽质粒进行双酶切和测序验证，最终得到黄素腺嘌呤二核苷酸强化表达载体pHY-ribE、pHY-ribF。

4.根据权利要求2所述的提高芽胞杆菌甘油代谢增加聚γ-谷氨酸产量的方法，其特征在于：还包括步骤S3：将过表达ribE、ribF中一种的芽胞杆菌进行种子培养、液体发酵；液体发酵培养基配方为：10-120g/L甘油；8-30g/L二水合柠檬酸三钠；0-25g/L NaNO₃；6-20g/LNH₄Cl；0.2-2g/L K₂HPO₄·3H₂O；0.2-2g/L MgSO₄·7H₂O；0.2-2g/LZnSO₄·7H₂O；0.2-2g/LCaCl₂；0.1-1.0g/L MnSO₄·H₂O，pH5.5～8.0；液体发酵条件为：发酵温度为30-40℃，装液量为8％-40％，摇床转速150-240r/min，发酵周期36-96h。

5.根据权利要求4所述的提高芽胞杆菌甘油代谢增加聚γ-谷氨酸产量的方法，其特征在于：所述种子培养基为LB培养基，配方为：10g/L蛋白胨；5g/L酵母浸出粉；10g/L氯化钠；pH7.0-7.2；固体培养基加琼脂18g/L；所述种子培养条件为：培养温度为37℃，装液量为20％，摇床转速230r/min，培养时间为10h。

6.一种聚γ-谷氨酸产量提高的重组地衣芽胞杆菌，其特征在于：所述重组地衣芽胞杆菌是通过在地衣芽胞杆菌WX-02中强化表达基因ribE或基因ribF而得到的，所述芽胞杆菌为产聚γ-谷氨酸的地衣芽胞杆菌WX-02，该菌保存于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCNO：M208065。