[发明专利]一种提高芽胞杆菌甘油代谢增加聚γ-谷氨酸产量的方法

说明书

本发明公开了一种通过强化黄素腺嘌呤二核苷酸的合成提高芽胞杆菌甘油代谢增加聚γ‑谷氨酸产量的方法。通过在芽胞杆菌中强化表达黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)合成途径中的三个关键基因ribE、ribF和ribH，分别构建了三株FAD强化合成的菌株。在不同的液体发酵条件下，ribE、ribF和ribH过表达使甘油代谢能力比对照菌株分别至少提高了22.02％，20.62％和23.92％，这些重组菌株的聚γ‑谷氨酸产量至少是对照菌株的1.20倍，1.18倍和1.27倍。由此表明，强化FAD合成可显著提高芽胞杆菌甘油代谢，增加聚γ‑谷氨酸合成。该方法能够提高甘油利用来增强目标产物的合成，在利用甘油为原料微生物发酵合成生物基化合物方面具有广泛的应用价值，为微生物高效利用甘油合成生物基化学品提供了一种新策略。

技术领域

本发明涉及基因工程和微生物学技术领域，具体涉及一种通过强化黄素腺嘌呤二核苷酸的合成提高芽胞杆菌甘油代谢增加聚γ-谷氨酸产量的方法。

背景技术

聚γ-谷氨酸是微生物发酵产生的具有多功能的高分子聚合物，由D-谷氨酸或L-谷氨酸单元通过γ-酰胺键连接而成的阴离子型化合物，具有良好的阳离子螯合、吸水保湿、无毒和可生物降解等特性，可作为药物载体、矿物营养强化剂、絮凝剂、保湿剂、肥料促进剂，用于医药、食品、水处理、化妆品及农业等领域。目前工业化生产聚γ-谷氨酸主要原料为高成本的葡萄糖和谷氨酸等，致使聚γ- 谷氨酸的生产成本较高，严重制约聚γ-谷氨酸相关产业链的快速发展，必须寻求廉价易得的替代性原料。粗甘油是廉价、可再生的生物废弃资源，是非常适合用于发酵生产聚γ-谷氨酸的替代原料。

芽胞杆菌属，包括地衣芽胞杆菌、枯草芽胞杆菌和解淀粉芽胞杆菌能够利用甘油发酵合成聚γ-谷氨酸，目前利用甘油发酵聚γ-谷氨酸技术存在着发酵周期长(甘油代谢速度慢)及生产转化率低等问题，限制了甘油的利用。因此，提高甘油代谢速率是甘油作为原料发酵生产聚γ-谷氨酸的关键因素。黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)是微生物细胞内核黄素的活性型，作为某些氧化还原酶的辅基，广泛参与胞内多种氧化脱氢反应，同时可以作为电子传递链传递氢的作用。其氧化型和还原型分别简写为FAD和FADH₂。因此，胞内FAD合成和再生是生物催化和细胞代谢是非常重要的。在黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)合成是以三磷酸鸟苷和核酮糖5-磷酸为前体，通过嘧啶和蝶啶中间体合成反应生产的中间体，在三个关键酶洛马津合酶、二氧四氢蝶啶合酶和核黄素合酶和双功能核黄素激酶/FMN腺苷酰转移酶的催化下生成FAD，这三个酶分别由ribH、ribE 和ribF基因编码。黄素腺嘌呤二核苷酸合成途径的强弱与甘油代谢速率及聚γ- 谷氨酸的产量之间的关系并无报道。

发明内容

本发明的目在于提供一种通过在芽胞杆菌中强化黄素腺嘌呤二核苷酸的合成加速甘油代谢，从而提高聚γ-谷氨酸产量的方法，此方法通过在芽胞杆菌中的基因组内强化表达黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)合成途径中的关键基因ribE、ribF 和ribH，FAD强化表达菌株甘油代谢速率比对照菌株提高，聚γ-谷氨酸产量比对照菌株提高，该研究结果表明强化表达FAD的合成是一种十分有效的提高微生物利用甘油的速率，提高聚γ-谷氨酸的方法，本研究为微生物高效利用甘油合成生物基化学品提供了一种新策略。

本发明第一方面提供了提高芽胞杆菌甘油代谢增加聚γ-谷氨酸产量的方法，步骤包括：在芽胞杆菌中强化表达黄素腺嘌呤二核苷酸合成途径中的关键基因，所述关键基因为ribE、ribF、ribH中的一种，所述基因ribE核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:1所示，所述基因ribF核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:2所示，所述基因ribH核苷酸序列如序列表SEQID NO:3所示。

优选的，所述在芽胞杆菌中强化表达黄素腺嘌呤二核苷酸合成途径中的关键基因的步骤包括：

S1、黄素腺嘌呤二核苷酸强化表达载体构建：扩增关键基因ribE、ribF、ribH 中的一种、P43启动子和终止子TamyL，并将其重组到一起构成P43-ribH/ribE/ ribF–TamyL，与载体连接得到黄素腺嘌呤二核苷酸强化表达载体pHY-ribH/ribE/ ribF；